Иммунологические методы исследования. Классические и современные варианты

Иммунологические

методы

Название свое эти методы получили потому, что основным действующим лицом в них является антитело — центральный белок иммунной системы. У человека и животных антитело выполняет важную функцию — распознает чужеродную молекулу, которая вторглась во владения организма, как непрошеный гость. По-научному такие молекулы-чужаки называют антигенами . А умение антител распознавать особые антигены называется специфичностью.

Большинство иммунологических методов основано на взаимодействии антиген-антитело. Все они позволяют обнаруживать неизвестный компонент этого взаимо- действия (например, любой сывороточный протеин, иммуноглобулин, цитокин, свободный рецептор и др.) Эти методы могут быть разделены на три группы:

•реакции преципитации,

•агглютинации

•Лизиса

Реакции преципитации различаются по использованию поликлональных или моноклональных антител

Современные подходы также включают применение дополнительных меток (энзим, радиоактивный элемент или флюорохром) для повышения чувствительности исследований или проведения иммуногистохимического окрашивания тканей. Функциональные методы, такие как исследования фагоцитоза и миграции, реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) и цитотоксические тесты, позволяют оценивать различные свойства клеток и иммунных процессов, хотя два последних метода также дают возможность определить наличие специфического компонента. Наконец, молекулярно-биологические технологии, включая пoлимеазную цепную реакцию (ПЦР), являются наиболее точными для идентификации кодирующего белок гена.

РАДИАЛЬНАЯ ИММУНОДИФФУЗИЯ

Сначала специфическая поли-клональная антисыворотка сме-шивается с агаром и разлива-ется в чашки Петри. Затем ис- следуемый образец помещается в одни лунки, а стандартный белок в известной концент-рации в другие. В течение 24-48 ч эти белки как антигены диф-фундируют навстречу специфи-ческим антителам, образуя кольца преципитации. Размер колец будет соответствовать количеству исследуемого белка.

Метод позволяет про-водить вручную опре-деление иммуноглобу-линов и других белков

НЕФЕЛОМЕТРИЯ

Нефелометрические методы используются для автомати- зированного и более чувстви-тельного определения иммуно-глобулинов и других белков. Исследуемый образец смешива-ется со специфическими поли-клональными антителами в кю- вете, где они связываются в иммунные комплексы. По плот-ности среды при пропускании через кювету лучей лазера можно судить о концентрации исследуемого антигена.

Коиммунопреципитация

•предназначена для выделения антигена вместе с белками, которые с ним связаны. В таких случаях известный антиген называют белком-приманкой (bait protein), а белки, с которыми он взаимодействует, белками-жертвами (prey protein(s)). Жертвами могут быть структурные белки, сигнальные молекулы, кофакторы и т. д.

•На матриксе иммобилизованы структуры, которые способны специфически связываться с определенными биомолекулами, например, с Fab- или Fc-фрагментами антител человека или мыши, аффинными концевыми структурами белков (GST или олигогистидиновыми), биотинилированными молекулами.

•При взаимодействии анализируемых молекул с биосенсором происходит изменение преломления светового пучка внутри биосенсора, которое регистрируется прибором и отображается на мониторе компьютера в виде кривых ассоциации/диссоциации.

Иммуноферментный анализ

•– выявление антигенов или антител с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой (пероксидазой хрена, бетагалактозидазой или щелочной фосфатазой).

1.Получаем антитела к Белку Х.

2.Добавляем исследуемый раствор (клеточный лизат, плазму крови или что-то еще) в лунку специального планшета из адгезивного

3.Промываем лунку, чтобы избавиться от незакрепившихся в ней белков и небелковых молекул.

4.Добавляем «забивку» — какие-нибудь белки, которые займут пустые места в лунке и не позволят налипнуть туда антителам (которые тоже белки!). Как правило, в качестве забивки используют обезжиренное молоко или БСА — бычий сывороточный альбумин, один из самых дешевых и при этом неиммуногенных белков.

5.Промываем лунку от лишней забивки.

6.Добавляем в лунку антитела к Белку Х. Теперь цепочка такова: Белок Х за планшет, антитело — за Белок Х.

7.Промываем лунку от лишних антител.

8.добавим в лунку вторичные антитела — то есть антитела к антителам к Белку Х. К каждому такому антителу методом биоконъюгации пришит специальный фермент, катализирующий реакцию, в результате которой получаются цветные, хорошо заметные Но пока мы просто в очередной раз промываем лунку.

9.добавляем в эту лунку субстрат для фермента. Проходит «цветная» реакция, результаты которой видны и невооруженным глазом. если нам важно померить количество искомого Белка Х, засунем планшет спектрофотометр, покажет, насколько сильно окрашен раствор. По интенсивности окраски раствора мы сможем вычислить концентрацию нашего Белка Х.

•Например, для детекции малых количеств антигена в пробе используют так называемый сэндвич-ИФА. В лунки планшета изначально вносят антитела, специфичные к детектируемому антигену, которые прилипают к поверхности пластика. Дальше повторяются уже известные нам шаги: добавляется антиген, а следом за ним еще одни антитела, специфичные к нему. Получается структура, действительно напоминающая сэндвич: антиген оказывается между двумя антителами и «не теряется»: удается определить даже крохотные его количества.

•Конкурирующий ИФА — еще одна модификация метода, в которой исследуют концентрацию не антигена, а наоборот, антител. Если вы когда-нибудь сдавали кровь на антитела, то анализ проводили именно этим способом. В этом случае в лунки планшета, в которые нанесен антиген, добавляют исследуемые антитела (например, сыворотка крови) — назовем их «антителами А» — и антитела, помеченные ферментом, специфичным к антигену («антитела Б»). Между антителами разгорается нешуточная борьба за право связаться с антигеном. Соответственно, чем меньше в пробе «антител А», тем больше «антител Б» свяжется с антигеном и тем ярче будет сигнал.