ИФА. ПИФ. Иммуноэлектрофорез. Ихла. Иммуноблотинг

Иммуноферментный анализ

•выявление антигенов или антител с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой (пероксидазой хрена, бетагалактозидазой или щелочной фосфатазой).

1.Получаем антитела к Белку Х.

2.Добавляем исследуемый раствор (клеточный лизат, плазму крови или что-то еще) в лунку специального планшета из адгезивного

3.Промываем лунку, чтобы избавиться от незакрепившихся в ней белков и небелковых молекул.

4.Добавляем «забивку» — какие-нибудь белки, которые займут пустые места в лунке и не позволят налипнуть туда антителам (которые тоже белки!). Как правило, в качестве забивки используют обезжиренное молоко или БСА — бычий сывороточный альбумин, один из самых дешевых и при этом неиммуногенных белков.

5.Промываем лунку от лишней забивки.

6.Добавляем в лунку антитела к Белку Х. Теперь цепочка такова: Белок Х за планшет, антитело — за Белок Х.

7.Промываем лунку от лишних антител.

8.добавим в лунку вторичные антитела — то есть антитела к антителам к Белку Х. К каждому такому антителу методом биоконъюгации пришит специальный фермент, катализирующий реакцию, в результате которой получаются цветные, хорошо заметные Но пока мы просто в очередной раз промываем лунку.

9.добавляем в эту лунку субстрат для фермента. Проходит «цветная» реакция, результаты которой видны и невооруженным глазом. если нам важно померить количество искомого Белка Х, засунем планшет спектрофотометр, покажет, насколько сильно окрашен раствор. По интенсивности окраски раствора мы сможем вычислить концентрацию нашего Белка Х.

•Например, для детекции малых количеств антигена в пробе используют так называемый сэндвич-ИФА. В лунки планшета изначально вносят антитела, специфичные к детектируемому антигену, которые прилипают к поверхности пластика. Дальше повторяются уже известные нам шаги: добавляется антиген, а следом за ним еще одни антитела, специфичные к нему. Получается структура, действительно напоминающая сэндвич: антиген оказывается между двумя антителами и «не теряется»: удается определить даже крохотные его количества.

•Конкурирующий ИФА — еще одна модификация метода, в которой исследуют концентрацию не антигена, а наоборот, антител. Если вы когда-нибудь сдавали кровь на антитела, то анализ проводили именно этим способом. В этом случае в лунки планшета, в которые нанесен антиген, добавляют исследуемые антитела (например, сыворотка крови) — назовем их «антителами А» — и антитела, помеченные ферментом, специфичным к антигену («антитела Б»). Между антителами разгорается нешуточная борьба за право связаться с антигеном. Соответственно, чем меньше в пробе «антител А», тем больше «антител Б» свяжется с антигеном и тем ярче будет сигнал.

Мультиплексная ИФА

Иногда требуется проводить иммуноферментный анализ нескольких десятков белков, дабы определить общую картину. Учитывая количество аналитов и длительность ИФА, такой подход не очень удобен и совсем не быстр.

Для решения таких комплексных задач применяют мультиплексный анализ на основе технологий микрочастиц.

В основе технологии — использование полимерных микросфер, несущих на поверхности зонды к определенным молекулам. Микросферы содержат два флуорофора в различных концентрациях, соотношение которых позволяет создавать разные спектральные характеристики у разных микросфер. Каждый тип частиц несет уникальный вид зонда и обладает уникальным спектром. Этот спектр распознается анализатором Luminex

ПИФ – прямая иммунофлюоресценция

Сущность метода заключается в визуализации антигена специфическими антителами с флуоресцентными маркерами.

При прямом методе на исследуемый препарат или в суспензию клеток наносят раствор прямо меченых флюоресцентным красителем антител. Образование комплекса антиген-антитело обнаруживается флюоресцентным сигналом в виде свечения разной степени интенсивности и четкости.

Иммуноэлектрофорез

•Иммуноэлектрофоретический анализ представляет собой сочетание электрофореза в агаровом геле с иммунодиффузией.

•Принцип ИЭФ состоит в следующем. Вначале проводят электрофоретическое разделение белков (антигенов) в забуференном геле агара; после снятия напряжения вдоль направления движения белков в электрическом поле в геле вырезают канавку, в которую вносят преципитирующую иммунную сыворотку. Антиген и антисыворотка диффундируют в геле навстречу друг другу, и в месте их взаимодействия возникают дугообразные линии преципитации, число, положение и форма которых дают представление о составе исходной смеси антигенов.

•С помощью данного метода в клинической иммунологии полуколичественно определяют концентрацию иммуноглобулинов различных классов, идентифицируют миеломные белки. Также ИЭФ используется при диагностике иммунодефицитных состояний. Метод незаменим в последовательном наблюдении за процессом очистки белковых препаратов. Его часто используют также для контроля подлинности и чистоты этих препаратов.

•Для разделения сложной смеси антигенов используют двухмерный (перекрестный) электрофорез. Метод включает два этапа. На первом этапе белки диффундируют под влиянием электрического поля в агарозном геле, содержащем антитела. На втором этапе пластину поворочивают на 90о и подвергают повторный разгонке в направлении, перпендикулярном первому. Таким образом удается количественно охарактеризовать каждый из антигенов смеси. Этот метод, в частности, применяют для оценки степени конверсии белка системы комплемента С3 в инактивированную форму С3с в сыворотке больных СКВ или синовиальной жидкости больных ревматоидным артритом.

Иммунохемилюминесцентный анализ (ИХЛА)

•В основе ИХЛА лежит принцип хемилюминесценции – явления излучения света в видимом диапазоне (длины волн варьируются от 300 до 800 нм) в результате химической реакции, возникающее при излучательном переходе электронов атомов или молекул из возбужденного в основное состояние, в сочетании со специфическим взаимодействием антигена с антителом

•Различается конкурентный и неконкурентный, а также прямой и непрямой ИХЛА. В прямом ИХЛА в качестве люминесцентных меток применяются люмиол и изолюмиол, а также эфиры акридия и рутения, которыми химически модифицируется регистрируемый антиген, либо специфичное ему антитело. В непрямом ИХЛА применяются ферментные метки, например, щелочная фосфатаза с адамантил-1,2-диоксентанарилфосфат в качестве субстрата или пероксидаза хрена с люминолом или его производными в качестве субстрата.

•Одним из наиболее распространенных видов ИХЛА является электрохемилюминесцентный иммуноанализ (ЭХЛИА), сочетающий в себе преимущества электрохимических методов и ИХЛА. В основе ЭХЛИА лежит принцип электрохемилюминесценции – излучения света в видимом диапазоне в результате электрохимических реакций. ЭХЛИА обычно наблюдается при подаче небольшого потенциала (несколько вольт) на электроды электрохимической ячейки, содержащей раствор люминесцентных частиц (полициклических ароматических углеводородов, квантовых точек или наночастиц) в апротонном органическом растворителе (диметилсульфоксид, диметилформамид, диоксан, тетрагидрофуран)

•В результате, на одном или разных электродах получаются окисленные и восстановленные формы люминесцентных частиц. Энергия возбуждения, необходимая для перехода электронов молекул в возбужденное состояние с последующей релаксацией с выделением электромагнитного излучения, получается при рекомбинации окисленных и восстановленных частиц. Комбинация метода электрохемилюминесценции с тем или иным форматом иммуноанализа позволяет чувствительно регистрировать как макромолекулы, так и низкомолекулярные соединения