Большой практикум / Культивирование / Влияние концентрации азота на характеристики культуры

Цель работы: продемонстрировать потенциальные возможности параметрически управляемого культивирования микроорганизмов для получения целевых продуктов.

Ход работы:

1.Студентам разделиться на 4 группы по числу заданных значений концентрации хлористого аммония в среде (1,0; 0,6; 0,4 и 0,2 г/л).

2.Каждой группе приготовить вариант питательной среды Шлегеля для бактерий с заданным значением азота в двух повторностях:

•в микробиологическом боксе в колбу на 0,5 л с 200 мл фосфатного буфера

(Na2HPO4∙H2O – 9,1 г/л; KH2PO4 – 1,5 г/л) добавить 16 мл раствора фруктозы, 2 мл раствора сульфата магния (MgSO4 – 12 г/л), 1 мл лимоннокислого железа (Fe3C6H5O7∙7H2O – 50 г/л), 0,6 мл раствора микроэлементов (H3BO3 – 0,228 г/л; CoCe2∙6H2O – 0,030 г/л; СuSO4∙5H2O – 0,008 г/л; MnCe2∙4H2O – 0,008 г/л; ZnSO4∙7H2O – 0,176 г/л; NaMoO4∙2H2O – 0,050 г/л; NiCe2 – 0,008 г/л), NH4Cl исходя из заданной концентрации (2 мл для получения концентрации 1 г/л);

•в полученную среду добавить 10 мл инокулята культуры;

•колбы плотно закрыть резиновыми пробками, подписать;

•на ФЭК измерить оптическую плотность (без разведения) каждого инокулята в кювете 0,1 см на длине волны λ = 440 нм против воды;

3. Определить концентрацию фруктозы:

•2 мл культуральной жидкости отцентрифугировать при 6000 g в течение 2

минут;

•0,5 мл супернатанта развести в 24,5 мл воды (разведение в 50 раз);

•1 мл полученного раствора поместить в пробирку, куда добавить 3 мл раствора HCl (5:1) и 1 мл спиртового раствора резорцима;

•приготовить контроль, используя воду вместо надосадочной жидкости;

•поместить пробирки на водяную баню на 20 минут;

2

•на ФЭК измерить оптическую плотность каждого раствора в кювете 0,5 см на длине волны λ = 540 нм против контрольной пробы;

•построить калибровочный график, используя растворы фруктозы с известной концентрацией (2, 5, 10 и 20 г/л);

•найти концентрацию фруктозы в исследуемых растворах с помощью калибровочного графика (у = 0,0194 х + 0,1092);

4. Определить концентрацию азота:

•2 мл культуральной жидкости отцентрифугировать при 6000 g в течение 2

минут;

•0,5 мл супернатанта развести в 49,5 мл воды (разведение в 100 раз);

•добавить каплю щелочи (33% KOH) и 0,5 мл реактива Несслера;

•сразу измерить оптическую плотность каждого раствора в кювете 1 см на длине волны λ = 400 нм против воды;

•найти концентрацию азота в исследуемых растворах с помощью калибровочного графика (y = 1,6919 x – 0,1472);

5.Внести полученные данные в таблицу:

Таблица 1 – Начальные значения

0 ч

6.Через 16 часов повторить измерения оптической плотности культуральной жидкости с разведением (1 мл культуры и 5 мл воды) и без; определить концентрацию фруктозы и азота;

7.Измерить биомассу:

3

•20 мл культуральной жидкости отцентрифуриговать при 6000 g в течение

10 минут;

•промыть дистиллированной водой 3 раза, центрифугируя при тех же условиях;

•полученную биомассу перенести в заранее взвешенные бюксы и поставить сушиться при температуре 90 ;

•биомассу определять, как разницу между весом наполненного и пустого бюкса:

15,490 – 15,457 = 0,033 г

13,901 – 13,878 = 0,023 г x̅= 0,028 г

•по данным хроматографии масса полимера составила 44% от общей массы сухого остатка

Масса полимера (1 г/л) = 0,028 ∙ 50 = 1,4 г/л ∙ 44% = 0,61 г/л.

• внести полученные данные в таблицу:

Таблица 2 – Конечные значения

16 ч

4

μ, ч-1

0,175

0,17

0,165

0,16

0,155

0,15

0,145

0,14

0,135

S NH4Cl, г/л

0,13

Рисунок 4 – График зависимости удельной скорости роста бактерий от концентрации NH4Cl в среде

11. Рассчитать константу насыщения KS и лимитирования KI. Для этого данные обработать по методу обратных величин Лайнуевера-Берка,

построить график и графически найти величину:

Таблица 4 – Линеаризация методом Лайнувера-Берка

7

Рисунок 5 – График линеаризации методом Лайнувера-Берка для KS

По полученному графику, 1/ KS = – 14,2; KS = – 0,07.

Рисунок 6 – График линеаризации методом Лайнувера-Берка для KI

По полученному графику, 1/ KI = – 0,41; KI = – 2,4. По причине того, что значение удельной скорости роста для концентрации NH4Cl было найдено некорректно, константа лимитирования искалась исходя из значения μ (1,0) = 0,25.

8

Выводы:

1.Наибольшая биомасса должна была быть выделена при концентрации азота

1,0 г/л, однако при раскручивании произошла ошибка эксперимента, и не весь осадок был перенесен в бюксы, из-за чего значения биомассы не совпадают с ожидаемыми.

2.В результате нашего эксперимента было выявлено, что наиболее оптимальными концентрациями азота для синтеза полимера являются 0,4

г/л и 0,6 г/л, т. к. содержание в них полимера максимально (0,8 г/л и 0,81 г/л

соответственно). При концентрации азота 0,6 г/л наблюдается меньшее процентное содержание полимера, но большая биомасса (53%, 1,5 г), а при концентрации азота 0,4 г/л противоположное (58%, 1,3 г).

3.Бактерии запасают полимер, когда в среде имеется дефицит азота. При концентрации 1,0 г/л азота много, и происходит рост культуры без синтеза полимера (содержание полимера минимальное, биомасса максимальная).

При концентрации 0,2 г/л азота мало, и клетки запасают полимер, чтобы выжить, однако рост не такой активный (содержание полимера максимальное, биомасса минимальная).

4.Таким образом, наиболее подходящими для культивирования клеток и получения целевого продукта (полимера) являются концентрации азота в среде 0,4 г/л и 0,6 г/л.

9