Большой практикум / 8_Поляризация

Поляризационные исследования флуоресценции биологических объектов

АННОТАЦИЯ

В ходе работы были зарегистрированы спектры и анизотропия люминесценции растворов с разной степенью связывания белка с красителем и на основе этого установлена константа диссоциации, равная 0,77 µМ. Полученная константа диссоциации совпадает с теоретической (K ≈ 0,7 µМ). Значения анизотропии возрастали с увеличением концентрации белка.

ВВЕДЕНИЕ

Флуоресценция молекул может стать важным источником информации о процессах, протекающих в биологических системах различной сложности. Экспериментальные методы детектирования излучения в оптическом диапазоне к настоящему времени развились настолько, что позволяют регистрировать испускание нескольких фотонов. Такая чувствительность делает флуоресцентную спектроскопию незаменимым инструментом для изучения живых систем на молекулярном уровне. При исследовании структуры и динамики биологических объектов с помощью природных и искусственных флуорофоров для получения необходимой информации могут быть использованы следующие параметры:

• интенсивность люминесценции,

• спектр флуоресценции (положение максимума, полуширина),

• время жизни флуоресцентного состояния,

• характеристики поляризации (или анизотропии) флуоресценции.

Последние параметры, изучаемые при возбуждении объекта поляризованным светом, являются источником важной информации как о характеристиках микроокружения излучающей частицы (вязкости среды, температуре и др.), так и о процессах, в которые объект исследования может быть вовлечен (денатурация белков, ассоциация белков между собой и с лигандами, связывании субстратов и др.)

Измерение фундаментальной анизотропии требует специальных условий. Для того чтобы исключить диффузионное вращение, флуорофоры помещают в стеклообразные растворы, такие, как пропиленгликоль при -70С. Кроме того, растворы должны быть достаточно разбавленными, чтобы исключить деполяризация из-за перепоглощения излучения или резонансного переноса энергии. При таких условиях флуорофоры остаются неподвижными в течение времени нахождения в возбужденном состоянии. Тогда измерение значения r₀ позволяет определить угол между диполями поглощения и испускания . Так как ориентация диполей поглощения различна для каждой полосы поглощения, то угол  и r₀ меняются с длиной волны. Спектр анизотропии – это график зависимости анизотропии флуоресценции от длины волны для флуорофора в вязком разбавленном растворе. Обычно анизотропия не зависит о длины волны испускания, поэтому приводятся только спектры анизотропии возбуждения. Наибольшее значение r₀, как правило, наблюдается для наиболее длинноволновой полосы поглощения. Это связано с тем, что флуоресценция обычно происходит из низшего флуоресцентного состояния, а оно также соответствует длинноволновой полосе поглощения (правило зеркальной симметрии). Следовательно, в поглощение и испускание вовлекается один и тот же электронный переход, который имеет приблизительно однонаправленные моменты. Большие значения  (меньшие значения r₀) получают при возбуждении в высшие электронные состояния, из которых обычно 15 не происходит испускания флуоресценции, поскольку флуорофоры быстрее релаксируют в низшее синглетное состояние. Спектр анизотропии выявляет углы между моментами переходов в поглощении и испускании, но направления этих моментов собственно в молекуле не определяет.

Часто квантовый выход флуорофора при связывании изменяется. Среднее значение анизотропии связано с долей от общего количества флуорофора, находящегося в связанном состоянии, выражением:

где f_связ - доля от общего количества флуорофора, находящегося в связанном состоянии, r_своб и r_связ - анизотропии свободного и связанного флуорофоров соответственно, R - отношение квантовых выходов связанной и свободной форм.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Характеристики флуоресценции красителя регистрируют на люминесцентном спектрометре Aminco-Bowman Series 2 (Thermo Spectronics, США). Для правильного управления работой данного прибора рекомендуется до начала эксперимента ознакомиться с его инструкцией по эксплуатации.

Образец помещают в стеклянную или кварцевую кювету 10х10 мм. Минимальный объем исследуемого раствора – 1,5 мл.

Измерение анизотропии флуоресценции проводят с помощью специального модуля люминесцентного спектрометра, включающего автоматически управляемые поляризаторы, расположенные на оптическом пути возбуждающего и испускаемого света. Перед началом работы на приборе следует убедиться, что поляризаторы правильно установлены, т.е. размещены на оптическом пути прибора.

Для определения константы связывания красителя с белком необходимо провести измерение параметров флуоресценции красителя (спектра испускания и анизотропии флуоресценции) в присутствии и отсутствии белка. Концентрация красителя и чувствительность регистрирующей системы (напряжение на ФЭУ и ширина щелей монохроматоров) в течение всего эксперимента должны оставаться неизменными.

РЕЗУЛЬТАТЫ

С=10^-3

С=10^-5

С=0

Рис. 1 – Спектры люминесценции красителя в присутствии белка разных концентраций

Таблица 1 ­— Характеристики флуоресценции красителя в присутствии белка разных концентраций

№	Концентрации, М		Характеристики флуоресценции
	Краситель	Белок	max, нм	Imax, отн.ед	P	r
1		0	579	14,884	0,01375	0,00921
2			580	14,8228	0,03692	0,02492
3			577	16,8024	0,1294	0,09019

f_связ = 0,175742

[1]

K=0,77

ВЫВОДЫ

Реакции ассоциации приводят к изменению структуры молекулы и соответственно к изменению анизотропии люминесценции.

Уровень анизотропии возрастает с увеличением концентрации белка.

На основе анализа анизотропии растворов с разной степенью связывания белка с красителем была установлена константа диссоциации 0,77 µМ.

Полученная константа диссоциации совпадает с теоретической (K ≈ 0,7 µМ) [2].

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ЛИТЕРАТУРА

1. Лакович Д., Козьменко М. В., Савицкий А. П. Основы флуоресцентной спектроскопии. – Мир, 1986.

2. Zhang Y., Görner H. Photoprocesses of xanthene dyes bound to lysozyme or serum albumin //Photochemistry and photobiology. – 2009. – Т. 85. – №. 3. – С. 677-685.