5. Определение чувствительности бактерий к антибиотикам

При использовании антибиотиков выраженный лечебный эффект достигается

в случае применения тех препаратов, к которым возбудитель наиболее чувствителен. Определение чувствительности возбудителя к антибиотикам проводится перед началом лечения и периодически – в ходе лечения. В настоящее время на практике используются следующие методы определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам.

1. Метод серийных разведений в жидких средах. В жидкие среды с серийными разведениями антибиотиков вносят исследуемую культуру, инкубируют посевы 10-18 часов при 37°С, и учитывают результаты визуально или нефелометрически. Иногда в среду добавляют глюкозу и индикатор, что позволяет учитывать результаты по изменению окраски среды. Этот метод позволяет установить минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) или минимальную подавляющую концентрацию (МПК) препарата для конкретного возбудителя. Исследование можно выполнять в различных объемах питательной среды - от 1 до 10 мл; в качестве питательной среды обычно используют МПБ или любую другую среду, соответствующую питательным потребностям возбудителя. В пробирках с питательной средой готовят серию двойных разведений антимикробного препарата. В качестве контроля используют пробирку с питательной средой без антибиотика. В каждую пробирку (с антибиотиком и контрольную) вносят суспензию бактерий с концентрацией 10⁶ микробных клеток/мл. Пробирки инкубируют 10-18 часов при 37°С (или до появления бактериального роста в контрольной пробирке). По истечении указанного срока учитывают результаты. МПК соответствует наибольшему разведению препарата, тормозящему рост тест-культуры (рисунок 13.17).

Концентрация антибиотика, мкг/мл 0 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32

Рост бактерий ^{Рост отсутствует} МПК

Рисунок 13.17 – Определение МПК методом разведения в жидкой питательной среде.

2. Метод серийных разведений в плотных средах. Метод аналогичен предыдущей процедуре, но проводится на плотных питательных средах. При использовании этого метода готовят серийные разведения антимикробного препарата, затем вносят каждое разведение в пробирки, содержащие охлажденную агаровую среду. Содержимое пробирки после перемешивания быстро переносят в чашки Петри либо пробирки “скашивают” до застывания агара. Затем агар засевают исследуемой культурой (петлей или специальным дозатором). Посевы инкубируют 18-20 часов при 37°С. После инкубирования посевов определяют МИК по отсутствию роста на чашках или в пробирках, содержащих наименьшие концентрации препарата.

3. Диффузионные методы. Эти методы менее чувствительны, чем методы

стандартных разведений, но проще по выполнению. На практике их применяют чаще. Эти методы позволяют определять чувствительность бактерий к нескольким антибиотикам одновременно.

Классический метод. В чашки Петри вносят тонкий слой (4-5 мм) плотной питательной среды. После застывания на поверхность агара наносят микробную взвесь (10⁵ клеток/мл) и равномерно распределяют по поверхности агара. Излишки суспензии удаляют, а чашки подсушивают в термостате. Затем в агаре пробивают лунки и в каждую вносят по 0,1 мл раствора исследуемого антибиотика, после чего чашки помещают в термостат. После инкубирования в оптимальных условиях измеряют диаметр зоны подавления роста вокруг лунки для каждого препарата (рисунок 13.18).

Рисунок 13.18 – Результат классического диффузионного метода определения чувствительности бактерий к антибиотикам.

Метод дисков (диско-диффузионный метод). Для определения чувствительности бактерий с помощью этого метода на агар высевают исследуемую культуру (суспензия, содержащая 10⁹ клеток/мл). После этого на поверхность агара промещают диски из фильтровальной бумаги, пропитанные антибиотиками. Для этого используют коммерческие диски, содержащие определенные концентрации антибиотиков (рисунок 13.19).

а б

Рисунок 13.19 – Диски с антибиотиками (а) и диспенсеры (аппликаторы) для одновременного нанесения 6-12 дисков (б).

Посевы инкубируют при 37°С в течение времени, необходимого для роста конкретного возбудителя. Вокруг дисков в зависимости от активности и концентрации антибиотика образуются разной величины зоны задержки роста исследуемого микроба (рисунок 13.20).

Рисунок 13.20 – Результаты диско-диффузионного метода определения чувствительности бактерий к антибиотикам.

За рубежом выпускаются гексадиски (6 объединенных дисков) и октодиски (8 объединенных дисков), позволяющие определять чувствительность бактерий одновременно к 6 или 8 антибиотикам (рисунок 13.21).

Рисунок 13.21 - Гексадиски и октодиски для определения чувствительности бактерий к антибиотикам.

Зоны задержки роста культур измеряют с помощью линейки. Полученные размеры зон сравнивают с величинами зон задержки роста, указанными в инструкции, после чего микроорганизмы относят к той или иной группе (чувствительным, умеренно чувствительным или резистентным). Показатели активности основных антибиотиков, определяемые методом стандартных индикаторных дисков, представлены в таблице 13.5.

Таблица 13.5 – Показатели активности основных антибиотиков, определенные методом стандартных индикаторных дисков

№№ пп	Антибиотики	Код диска (лат.)	Содержание антибиотика в диске, мкг	Диаметр зоны отсутствия роста, мм
				устойчивые	умеренно устойчивые	чувстви- тельные
1.	Азтреонам	АТМ (Ао)	30	≤15	16-21	≥22

2.	Амоксициклин (амоксиклав)	АКК (Ас)	10	≤10	11-12	≥13
3.	Ампициллин	АМП (А)	10	≤9	10-13	≥14
4	Бензилпенициллин	ПЕН (Р)	6	≤11	12-21	≥22
5.	Ванкомицин	ВА (Va)	30	≤14	15-16	≥17
6.	Гентамицин	ГЕН (G)	10	≤13	-	≥14
7.	Доксициклин	ДОК (Do)	10	≤12	13-19	≥20
8.	Канамицин	КАН (К)	30	≤14	15-18	≥19
9	Карбенициллин	КАР (Cb)	25	≤14	15-18	≥19
10.	Клиндамицин	КЛ (Cd)	2	≤14	15-20	≥21
11.	Левомицетин	ЛЕВ	30	≤14	15-18	≥19
12.	Линкомицин	ЛИН (L)	15	≤19	20-23	≥24
13.	Линезолид	(Lz)	30	≤20	21-22	≥23
14.	Меропенем	МПН (Mr)	25	≤13	14-15	≥16
15	Метициллин	МЕТ (М)	10	≤13	14-17	≥18
16.	Мономицин	МОН	30	≤13	14-17	≥18
17.	Неомицин	НЕО (N)	30	≤13	14-17	≥18
18.	Нетилмицин	НИЦ (Nt)	30	≤12	13-14	≥15
19.	Нитрофурантоин	(Nf)	300	≤14	15-16	≥17
20.	Оксациллин	ОКС (Ox)	10	≤19	20-23	≥24
21.	Олеандомицин	ОЛЕ (Ol)	15	≤12	13-17	≥18
22.	Офлоксацин	(Of)	5	≤12	13-16	≥17
23.	Полимиксин - В	ПОЛ (Pb)	300 ЕД	≤8	9-12	≥13
24.	Ристомицин	РИС	30	≤9	10-11	≥12
25.	Рифампицин	РИФ (R)	5	≤9	10-12	≥13
26.	Стрептомицин	СТР (S)	30	≤13	14-16	≥17
27.	Тетрациклин	ТЕТ	30	≤15	16-19	≥20

		(Т)
28.	Триметоприм	ТМ (Nr)	25	≤10	11-15	≥16
29.	Триметоприм / сульфаметоксазол	ТС	1,25 / 23,75	≤10	11-15	≥16
30.	Фузидин	ФУЗ (Fc)	10	≤12	13-19	≥20
31.	Фуродонин	ФД (Fr)	300	≤14	15-16	≥17
32.	Цефазолин	ЦЗ (Cz)	30	≤14	15-17	≥18
33.	Цефалексин	ЦФЛ	30	≤11	12-16	≥17
34.	Цефоперазон	ЦПН (Cs)	75	≤15	16-20	≥21
35.	Цефоперазон / сульбактам	ЦПС (Cfs)	75 / 30	≤15	16-20	≥21
36.	Цефтазидим / клавулановая кислота	(Cac)	30 / 10	≤14	15-17	≥18
37.	Эритромицин	ЭРИ (Е)	15	≤14	15-18	≥19

В случае, когда используются антибиотики, не указанные в таблице 13.5, используют универсальную оценочную шкалу (таблица 13.6).

Таблица 13.6 – Ориентировочная (универсальная) шкала оценки чувствительности микроорганизмов к антибиотикам при использовании диско-

диффузионного метода

Диаметр зоны торможения роста (в мм)	Чувствительность микроорганизмов
 10	нечувствительны
10 – 15	слабо чувствительны
15 – 20	чувствительны
 20 – 25	высокочувствительны

Таким образом, если зона задержки роста составляет 15-25 мм, то микробы считают чувствительными к антибиотикам, до 15 мм - малочувствительными, а отсутствие зоны указывает на резистентность бактериальной культуры к данному антибиотику. Этот метод используется только для “быстрорастущих” микроорганизмов, образующих сплошной рост на плотной питательной среде (в виде “газона”) через 18-20 часов экспозиции.

Е-тест представляет собой модификацию метода дисков. В этом тесте вместо дисков используется полоска, содержащая разные концентрации антибиотика на разных участках. Каждая зона полоски имеет соответствующую маркировку. Полоска помещается на поверхность агара с бактериальной культурой. Зона задержки роста культуры в этом тесте также имеет эллипсовидную форму.

Минимальной ингибирующей концентрации антибиотика соответствует тот участок полоски, где ее пересекает зона задержки роста исследуемой культуры (рисунок 13.22).

Рисунок 13.22 – Схема интерпретации результатов опыта и определение МПК с помощью Е-теста.

Автоматические системы учета результатов метода серийных разведений представляют собой инкубационные системы со встроенными фотометрами, регистрирующими рост бактерий в лунках микропанелей, содержащих антибиотики. Например, устройство VITEK 2 позволяет получать результаты уже через 4-10 часов, при этом определяет минимальную ингибирующую концентрацию более 100 антимикробных препаратов (рисунок 13.23).

Рисунок 13.23 – Устройство VITEK 2 для автоматической идентификации и определения чувствительности бактерий к антимикробным препаратам.

На практике величина МПК позволяет отнести исследуемый штамм микроорганизма к одной из трех общепринятых категорий:

• чувствительный микроб;

• умеренно-устойчивый микроб;

• устойчивый микроб.

Микроорганизм считается чувствительным, если у него нет устойчивости к данному лекарственному средству, и при лечении стандартными дозами этого препарата отмечается хорошая терапевтическая эффективность.

Устойчивым к антимикробному средству считают микроорганизм, если он

имеет механизмы резистентности к данному препарату и при лечении инфекций, вызванных этим микроорганизмом, нет клинического эффекта даже при использовании максимальных терапевтических доз этого препарата.

Микроорганизмы относятся к умеренно-устойчивым, если по своей чувствительности они занимают промежуточное значение между чувствительными и устойчивыми штаммами и при лечении инфекций, вызванных данными возбудителями, клинический эффект наблюдается только при использовании высоких терапевтических доз препарата.