Фриц Цернике
(1888 - 1966)
Голландский физик, лауреат Нобелевской премии по физике 1953 года «За обоснование фазово-контрастного метода, особенно за изобретение фазово- контрастного микроскопа».
В зависимости от размера фазовых колец и способа их получения различают:
положительный фазовый контраст, когда фазовое кольцо в объективе технологически получается путем травления, чтовносит
«опережение» в прямо прошедший свет, при этом изображение объекта с показателем преломления большим, чем у среды, получается темнее на более светломфоне;
отрицательный фазовый контраст (аноптральный или темнопольный фазовый контраст), когда фазовое кольцо в объективе технологически получается путем нанесения на поверхность стекла тонкой пленки, чтовносит
«запаздывание» в прямо прошедший свет, при этом изображение объекта с показателем преломления большим, чем у среды, выглядит светлее окружающего темного фона.
Фазовые объективы внутри имеют фазовый элемент (линза или пластина) с нанесенным кольцом, которое изменяет фазу и уменьшает амплитуду световой волны. Середина кольца в среднем составляет 1/2-2/3 от диаметра выходного зрачка объектива при этом светопропускание кольца – 10- 30% в зависимости от типа фазовогоконтраста.
Фазовый конденсор в плоскости апертурной диафрагмы имеет пластину с прозрачным световым кольцом. Размер светового кольца, вернееего
изображение, подбирается таким образом, чтобы оно соответствовало (или даже было чуть меньше) размеру фазового кольца объектива.
Люминесцентная и флуоресцентнаямикроскопия
Люминесцентная микроскопия (от лат.lumen– свет иescent– слабое свечение) основана на способности многих биологических объектов при освещении коротковолновыми лучами (синими, фиолетовыми, ультрафиолетовыми) поглощать их и испускать лучи с более длинной волной, видимые глазом человека.
Различают первичную и вторичную люминесценцию. Первичная люминесценция возникает при облучении необработанного объекта за счет его собственного свечения. В оптическую схему микроскопа вводятся два светофильтра. Один из них помещают перед конденсором. Он пропускает от источника-осветителя излучение волн только тех длин, которые возбуждают люминесценцию либо самого объекта (собственная люминесценция), либо специальных красителей, введённых в препарат и поглощённых его частицами (вторичная люминесценция). Второй светофильтр, который установлен после объектива, пропускает к глазу наблюдателя (или на фоточувствительный слой) только свет люминесценции. В люминесцентной микроскопии используют освещение препаратов как сверху (через объектив, который в этом случае служит и конденсором), так и снизу, через обычный конденсор. Наблюдение при освещении сверху иногда называют «люминесцентной микроскопией в отражённом свете» (этот термин условен - возбуждение свечения препарата не является простым отражением света). Его часто используют совместно с наблюдением по фазово-контрастному методу в проходящем свете.
Метод нашел широкое применение в микробиологии, вирусологии, гистологии, цитологии, в пищевой промышленности, при исследовании почв, в микрохимическом анализе, в дефектоскопии. Такое многообразие применения объясняется очень высокой цветовой чувствительностью глаза и высокой контрастностью изображения самосветящегося объекта на тёмном нелюминесцирующем фоне. Кроме того, информация о составе и свойствах исследуемых веществ, которую можно получить, зная интенсивность и спектральный состав их люминесцентного излучения, имеет огромную ценность. Не люминесцирующие объекты можно обработать специальными флюорохромами и также наблюдать люминесценцию, но это уже будет наведенная вторичная люминесценция. Она используется в микроскопии более часто.
К флюорохромам относят акридин желтый, акридин оранжевый,
аурамин, флюоресцеин и др., которые при обработке ими препарата, локализуясь в теле микробной клетки, обнаруживаются при люминесцентной микроскопии.
Люминесцентную микроскопию проводят с помощью иммерсионной системы, используя нефлюоресцирующее масло.
Преимуществами люминесцентной микроскопии являются: 1) цветное изображение; 2) высокая степень контрастности исследуемых объектов; 3) возможность изучения морфологии живых и убитых клеток микробов в питательных средах, тканях животных и растений; 4) возможность исследования различных жизненных процессов в динамике их развития; обнаружение и установление локализации отдельных бактерий и вирусов; 6) экспресс диагностика инфекционных болезней.
Флуоресценция и фосфоресценция - близкие понятия. Они означают свечение молекулы, которое индуцировано светом. Свет, который индуцирует флуоресценцию или фосфоресценцию, называется возбуждающим (exitaion), а испускаемый свет - эмиссией (emission). Как правило, длина волны возбуждающего света короче, чем длина волны испускаемого света (правило Стокса).
Электронная микроскопия
Электронный микроскоп – вакуумный электронно-оптический прибор. Он позволяет видеть такие мелкие детали, которые находятся вне разрешающей способности светового или люминесцентного микроскопа. Электронный микроскоп – это прибор, который широко применяется в научных исследованиях строения вещества, особенно в таких областях науки, как биология и физика твердого тела.
Полезное увеличение современных электронных микроскопов равно 1
млн раз, но чаще используют увеличение до 600000.
Источником «света» в электронном микроскопе служит пучок электрически ускоренных до больших энергий (30-100 КэВ и более) частиц – электронов. Длина волны потока электронов составляет 0,0055-0,0039 нм, что и было учтено при конструировании электронных микроскопов.
Просвечивающий (трансмиссионный) электронный микроскоп – используют проходящие через объект пучки электронов (разрешающая способность – 0,2-0,9 нм и более до 0,1 нм).
Растровый (сканирующий) электронный микроскоп – позволяет ис- следовать прозрачные и непрозрачные для электронов объекты, на которые направляется тонкий пучок электронов, непрерывно обегающий
(сканирующий) участок поверхности объекта (разрешающая способность 3 – 20нм).
Атомно-силовой микроскоп - дает возможность на атомном уровне проводить анализ структур разнообразных твердых материалов, таких как стекло, керамика, пластик, металл, полупроводники. В отличие отсканирующих туннельных микроскопов, при использовании атомно-силовых микроскопов измерение можно проводить не только в вакууме, но и на воздухе, в атмосфере любого газа и даже в капле жидкости. Прииспользовании атомно-силового микроскопа не требуется, чтобы образец проводил электричество. Все это делает атомно-силовой микроскоп незаменимым для исследования биологических объектов, например, кристаллов аминокислот, белков, клеточных мембран, молекул ДНК и других макромолекул и многогодругого.