bio_1 денисенко

Вариант № 1

Вопрос 1

Общие положения биотехнологии, возможности производства народохозяйственных продуктов.

Биотехнология – это «все виды работ, при которых из сырьевых материалов с помощью живых организмов производятся те или иные продукты».

• использование биологических объектов, систем или процессов для производства необходимых продуктов или для нужд сервисной индустрии;

• комплексное применение биохимических, микробиологических и инженерных знаний с целью промышленного использования потенциальных возможностей микроорганизмов, культур клеток и отдельных их компонентов или систем;

• технологическое использование биологических явлений для воспроизводства и получения (изготовления) различных типов полезных продуктов;

• приложение научных и инженерных принципов для обработки материалов биологическими агентами с целью получения необходимых продуктов или создания сервисных технологий. Биотехнология на самом деле не что иное, как название, данное набору технических приемов (подходов) и процессов, основанных на использовании для этих целей биологических объектов.

Биотехнологические направления имеют своей целью создание и практическое внедрение

• новых биологически активных веществ и лекарственных препаратов, используемых в здравоохранении для диагностики, профилактики и лечения различных заболеваний;

• биологических средств защиты сельскохозяйственных растений от возбудителей заболеваний и вредителей, бактериальных удобрений и регуляторов роста растений и животных; новых сортов растений, устойчивых к разного рода неблагоприятным воздействиям (факторам внешней среды); новых пород животных с полезными свойствами (трансгенные животные);

• ценных кормовых добавок для повышения продуктивности сельскохозяйственных животных (кормового белка, аминокислот, витаминов, ферментов, способствующих повышению усвояемости кормов, и т. п.);

• новых биоинженерных методов для получения высокоэффективных препаратов различного назначения, используемых в сельском хозяйстве и ветеринарии;

• новых технологий создания и получения хозяйственно ценных продуктов для пищевой, химической и микробиологической промышленности;

• эффективных технологий переработки сельскохозяйственных, промышленных и бытовых отходов для получения продуктов, которые могут использоваться в других отраслях хозяйственной деятельности человека (например, биогаза, удобрений, топлива для автомобилей.

Растения и большинство микроорганизмов способны синтезировать все входящие в их состав аминокислоты из простых веществ - углекислоты, воды и минеральных солей, тогда как в организме человека и животных некоторые аминокислоты не могут синтезироваться, и должны поступать в организм в готовом виде как компоненты пищи. Такие аминокислоты принято называть незаменимыми, к ним относятся  валин, лейцин, изолейцин, лизин, метионин, треонин, триптофан, фенилаланин. Отсутствие в пище хотя бы одной незаменимой аминокислоты приводит к тяжелым заболеваниям человека, а недостаток их в кормах снижает продуктивность с.х. животных. Главным источником незаменимых аминокислот для человека являются белки животного или растительного происхождения, входящие в состав пищи, а для с.х. животных - главным образом растительные белки.

Для правильного кормления с.х. животных необходимо, что бы в их кормовом рационе  в расчете на каждую кормовую единицу содержалось 100-120г хорошо перевариваемого и полноценного белка. Если содержание белков в растительной массе, используемой для кормления с.х. животных ниже, чем требуется по нормам, то во избежании перерасхода кормов и повышения себестоимости животноводческой продукции количества белка в корме балансируют путем добавления белковых концентратов.

Наряду с белками в микробных клетках образуются и другие ценные в питательном отношении вещества: легкоусвояемые углеводы, липиды с повышенным содержанием ненасыщенных жирных кислот, витамины, макро - и микроэлементы. При использовании микроорганизмов на ограниченной площади можно организовать промышленное производство и получать большое количество кормовых концентратов в любое время года, причем микробные клетки способы синтезировать белки из отходов сельского хозяйства и промышленности и, таким образом, позволяют одновременно решать другую важную проблему – утилизацию этих отходов в целях охраны окружающей среды.

Микроорганизмы имеют еще одно ценное преимущество – способность очень быстро наращивать белковую массу. В качестве источников кормового белка наиболее часто используют  различные виды дрожжей и бактерий, микроскопические грибы, одноклеточные водоросли, белковые коагуляты травянистых растений.

Вопрос № 2

Использование целлюлозосодержащих материалов для получения кормового белка, технология переработки кислотнных гидролизатов древесины, использование целлолитических м/о для прямой биоконверсии, ферментативный гидролиз растительных материалов.

Растительная биомасса.

Содержит большое количество сахаров (целлюлоза, состоящая из остатков молекулы глюкозы; гемицеллюлозы, состоящие из остатков арабинозы, галактозы, маннозы, фруктозы, ксилозы). На жидкой, содержащей сахара фракции гидролизата, выращивают дрожжи. Для получения кормовых дрожжей используется также послеспиртовая барда, подсолнечная лузга, хлопковая шелуха, отходы производства лубяных волокон (костер льна и конопли), свекловичный жом, отходы картофелекрахмального производства, пивоваренной, плодовоовощной, консервной промышленности и др. В качестве сырья для гидролизной промышленности используется солома злаковых культур, которая обычно протеинизируется, например, дрожжеванием, или усвояемость соломы повышается действием ферментных препаратов (пектофоетидина Г3х в комплексе с целловиридином Г3х или глюкаваморином Пх). Используются способы прямой биоконверсии растительной биомассы с помощью высших и низших грибов. С этой целью используются целлюлозоразрушающие грибы Chaetomium cellulolyticum, а также Aspergillus niger, Trichoderma и др.

Гидролиз с использованием целлолигнина для производства растительно-углеводного корма. В целях изменения путей снижения себестоимости гидролизного сахара и решения проблемы устранения образования гидролизного лигнина в качестве отхода производства И.И. Корольков, В.А. Быков, В.П. Леванова и др. [52] предложили новую комплексную схему переработки растительного сырья методом гидролиза, в которой предусматривается для переработки использовать гидролизаты, получаемые только из гемицеллюлоз сырья, а оставшийся целлолигнин превращать в растительно-углеводный корм для животных. В этом случае гидролиз гемицеллюлоз сырья проводят в мягких условиях при 140... 150 °С с отбором 6 гидромодулей гидролизата, которые позволяют получить почти количественный выход сахара с высокой доброкачественностью гидролизата при значительном снижении затрат. Оставшийся после перколяции и отжима гидролизата целлолигнин, содержащий около 2 гидромодулей 0,5 %-ного раствора серной кислоты, в целях обогащения его сахаром подвергают нагреванию до 170 . . . 180 °С, выдержке при этой температуре с последующей выгрузкой, нейтрализацией его газообразным аммиаком и сушкой. Полученный кормовой продукт имеет достаточно высокие кормовые свойства. По такому способу гидролиза наиболее целесообразно в гидролизно-дрожжевом производстве перерабатывать лиственную древесину, кукурузную кочерыжку и другие отходы сельскохозяйственных растений, содержащих повышенное количество легкогидролизуемых полисахаридов. Предложенный способ гидролиза прошел промышленные испытания, показавшие его эффективность.

Биоконверсия (биотрансформация) – это раздел биотехнологии, наука по изучению превращения одних органических соединений биологического сырья в другие под действием ферментных систем растительного, микробного и животного происхождения.

Целлюлолитические ферментные препараты используются при обработке целлюлозы. Сама целлюлоза или клетчатка представляет собой полисахарид общей формулы (С6Н10О5)n и содержится в клеточных стенках растений. При степени полимеризации n = 10 образует кристаллическую решетку. Нитевидные молекулы, взаимодействуя между собой, образуют прочные структуры – фибриллы. В объеме таких фибрилл существуют упорядоченные кристаллические участки, где молекулы расположены параллельно друг другу и связаны водородными связями. Сущеcтвуют также аморфные участки с неупорядоченной структурой. Микроорганизмы способны синтезировать целый комплекс целлюлолитических ферментов, которые последовательно катализируют процесс гидролиза целлюлозы до глюкозы. В ферментном комплексе различают три группы ферментных препаратов:Ci-фактор, Сx-фермент и целлюбиазу.

Целлюлолитические ферментные препараты нашли применение в целлюлозно-бумажной промышленности, медицинской промышленности (получении лекарственных веществ – стероидов из растений), в пищевой промышленности (при производстве растительных масел) и в сельском хозяйстве (в качестве добавок к кормам жвачных животных). На коммерческий уровень поставлено ферментативное разделение рацемических смесей аминокислот и эфиров терпенов. Такие смеси образуются при химическом синтезе, и разделение их по оптическим свойствам составляющих имеет важное практическое значение. Известно, что для этого можно использовать традиционные физико-химические и химические методы (хроматография; механическое разделение, избирательное взаимодействие энантиомеров с другими оптически активными веществами), но гораздо более эффективными и удобными оказываются процессы, основанные на стереоспецифичности ферментов:

1. Избирательное ацилирование аминов L-аминокислотами под действием ферментов папаина, бромелаина или фицина по приведѐнной ниже схеме: образующийся анилид L-аминокислоты нерастворим в воде и может быть легко отделен от D-изомера, а затем гидролизован.

2. Асимметричный гидролиз. В этом случае осуществляется стереоспецифический гидролиз производных аминокислот, в результате которого образуется только один энантиомер. Эфиры Lаминокислот гидролизуют с помощью протеолитических ферментов, например химотрипсина: Затем нужный продукт и не вступающие в реакцию D-эфиры разделяют по их растворимости в воде.

3. Использование амидаз. Эти ферменты из почек и поджелудочной железы млекопитающих или из микроорганизмов стереоспецифически гидролизуют амиды L-аминокислот. Образующуюся Lкислоту и непрореагировавший D-изомер затем разделяют методом дифференциальной растворимости. Амиды менее склонны к самопроизвольному гидролизу, чем эфиры, поэтому получаются более чистые препараты аминокислот.

4. Стереоспецифический гидролиз N-ацил -L-аминокислот под действием аминоацилазы или карбоксипепсидазы, приводит к образованию L-аминокислот по схеме: Принципы избирательного гидролиза аксиально или экваториально расположенной простой эфирной группы под действием ферментов лежит также в основе разделения рацемических смесей эфиров и терпенов.

Весьма перспективным представляется использование ферментов в качестве датчиков вредных и ядовитых веществ. Так, в качестве индикатора на фосфорорганические отравляющие вещества нервно-паралитического действия применяется холинэстераза. Ее так же можно использовать и для определения фосфорорганических пестицидов. Степень ингибирования этого фермента в присутствии ОВ или пестицидов оценивают электрохимическими или спектрофотометрическими методами. Подобно холинэстеразе карбоангидраза проявляет высокую чувствительность к хлорпроизводным алифатических углеводородов, а гексокиназа – к аналогичным производным ароматических углеводородов. Всѐ большее развитие получают технологические процессы с участием сложных ферментных систем, включающих коферменты. Так, созданы ферментные мембранные реакторы, катализирующие непрерывные процессы с регенерацией НАДН (восстановительное аминирование кетокислот, восстановление α - кетокислот в α - гидроксикислоты). Разработаны системы разделения рацематов посредством стереоспецифического активного транспорта. Например, мембрана, содержащая гексокиназу и фосфатазу, функционирует как насос, избирательно прокачивающий лишь D-глюкозу. Применение сопряженных ферментативных реакций с участием алкогольоксидазы и каталазы дрожжей Hansenulla polimorpha и формальдегиддисмутазы бактерии Pseudomonas putida позволило осуществить окисление метанола в муравьиную кислоту с выходом 88 – 94%. В промышленности большое будущее имеют ферменты, способные катализировать химические реакции в органической фазе (“каталитические антитела”), в частности липазы. Для деградации и модификации антропогенных органических соединений, поступающих в окружающую среду, используют ферменты разных классов и в том числе лакказу, лигниназу, тирозиназу, монооксигеназу, диоксигеназу и др.

К ферментам, катализирующим гидролиз некрахмаль­ных полисахаридов растительного сырья, относятся ферменты: целлюлолитического, гемицеллюлазного и пектолитического действия. Эти пре­параты снижают вязкость зернового сусла, повышают доступность крахмала для действия амилолитических ферментов, что приводит к увеличению концентрации растворимых углеводов и способствует более интенсив­ному разжижению и улучшению реологических свойств . Ферментные препараты гемицеллюлазного и целлюлолитического действия необходимы при пе­реработке ржаного и ячменного сырья в производстве спирта, пива и кормов. Эти виды сырья характеризуются повышенным содержанием целлюлозы, гемицеллюлозы и гумми-веществ, приводящим к геле- и студнеобразованию, повышению вязкости сусла и ухудшению его реологических показателей.

Практически все гемицеллюлазные ферменты можно разделить на три группы: 

β-D-глюканазы, β-ксиланазы и β-глюкозидазы;

К β-D-глюканазам относят группу ферментов, ката­лизирующую расщепление β-глюканов с β-1,2-, β-1,3-, β-1,4- и β-1,6-связями. В эту группу входят 6 энзимов: целлюлаза, или эндо-1,4-β-глюканаза, эндо-1,3-β-глю-каназа, эндо-1,6-β-глюканаза, ламинариназа, лихеназа и эндо-1,2-β-глюканаза.

К β-ксиланазам относится система ферментов, ка­тализирующих расщепление β-глюкозидных связей в β-ксиланах.

β-Глюкозидазы (целлобиазы) - ферменты экзогенного действия, катализируют расщепление с нередуцируемого конца β-1,4-связи в β-D-глюкозидах, высвобождая β-D-глюкозу.

При переработке растительного сырья ферменты гемицеллюлазного действия (β-глюканазы и ксиланазы), катализирующие гидролиз полисахаридов с образова­нием глюкозы и пентоз, выполняют свою определенную функцию, связанную с их специфичностью и механиз­мом действия.

В результате анализа большого массива эксперимен­тальных данных выявлена зависимость реологичес­ких и биохимических характеристик зернового сусла и показателей бражки от концентрации гемицеллюлаз. При этом установлено, что использование фер­ментных препаратов - источников β-глюканаз -в результате ферментативной деполимеризации глюканов зерна позволяет повысить содержание глюкозы в реакционной среде и тем самым способствовать увеличению выхода целевого продукта. Применение ферментных препаратов ксиланолитического действия обеспечивает снижение вязкости сусла и улучшение его реологических показателей, что способствует интенси­фикации процесса биоконверсии полимеров зернового сырья.

Вопрос № 3

Производство бутанола и ацетона.

Ацетон и бутанол - единственные важные химические вещества, которые в больших количествах получают путем бактериального брожения.

Ацетонобутиловое брожение.

Ацетонобутиловое брожение вызывают анаэробы, спорообразующие клостридии, их постоянное местообитание — почва, они образуют споры по клостридиальному типу залегания. Так же, различают бациллярный и плектродиальный вид залегания спор. Спорообразующие клостридии проводят маслянокислое ацетонобутиловое брожение. Вначале, клетки образуют кислоты, а во вторую фазу брожения, они преобразуют кислоты в нейтральные продукты (ацетон, этанол, бутанол) — ацетонбутанол-этанольное (АБЭ) брожение, поскольку нейтральные и конечные продукты брожения — спирты. Это свойство используется людьми для получения ацетона и этанола в промышленных процессах. Ещё одним важны продуктом этого брожения является водород, на этапе образования пировиноградной кислоты при действии феррродоксинзависимой дегидрогеназы образуется пировиноградная кислота и ацетилкофермент А. Поэтому, это брожение сопровождается образование смеси водорода и углекислого газа. Из смеси выделяют водород, который идет в химическую промышленность в качестве восстановителя. Схема ацетонобутилового брожения начинается с глюкозы. В промышленности процессы ведутся не на чистой глюкозе, а на крахмалах. Это может быть гидролизованный крахмал (раствор глюкозы), либо крахмал, который добавляется в ферментеры, который расщепляется клостридиями до глюкозы, которая используется в качестве субстрата процесса брожения. Из глюкозы под действием гликолиза образуется две молекулы пировиноградной кислоты. Под действием ферридоксинзависимая пируватдегидрогеназа, образуется восстановленный ферридоксин, из которого образуется 2 молекулы водорода. Из 2 пировиноградных молекул образуется 2 молекулы ацетилкофермента А и СО2. 2 молекулы ацетилкофермента А идет на образование ацетоацетилкофермент А, который превращается в бутирилкофермент А. Бутирилкофермент А присоединяет неорганический фосфор, превращается в бутирилфосфат (макроэргическое соединение). Из акта субстратного фосфорилирования образуется АТФ и бутират (масляная кислота). С другой стороны, ацетоацетил А может идти на образование ацетилфосфата с отщеплением кофермента А. Ацетилфосфат превращается в ацетат. Под действием субстратного фосфорилирования (АДФ в АТФ) образуется в ацетат. Так же, возможно образование небольшого количества лактата при помощи лактатдегидрогеназы из пирувата. Данные превращения происходят в первой фазе, когда клетка выделяет окисленные продукты. Происходит снижения рН до значения 5. При рН=5, в клетке начинает работать ген, который выделяет ацетатдекарбоксилазу — фермент, который работает на второй стадии процесса при котором образуются нейтральные продукты. На втором этапе, ацетат обменивается с ацетоацетилкоферментом и превращается в ацетоацетилкофермент. Ацетоацетилкофермент А обменивается с коферментом А и получается ацетоацетат. Из ацетоацетата образуется ацетон + СО2 (нейтральный продукт). Под действием восстановленного пиридиннуклеотида, ацетон может превратиться в изопропанат (нейтральный продукт). Бутират обменивается с ацетоацетилкоферментом А и превращается в бутирилкофермент А, который превращается в бутират (бутилальдегид). Который восстанавливается в бутанол под действием бутирилнуклеотида. Ацетилкофермент А восстанавливается до ацетальдегида, который восстанавливается в этанол (нейтральный продукт) под действием восстановленного пиридиннуклеотида. Кислые продукты уходят н восстановление и рН вновь повышается. Существует обмен: фермент ацетоацетатдекарбоксилаза активируется при рН меньше или равным 5. С его помощью начинается процесс перехода из ацетона в ацетоацетат, путем декарбоксилирования. Далее, образуется ацетоацетаткофермент А, который может идти на образование бутанола или этанола. Суть процесса — ацетат уходит из среды на образование нейтральных продуктов. Аналогично, бутират обменивается с ацетоацетилкоферментом А, получается бутирилкофермент А, который уходит на образование бутанола. Таким образом, образуется саморегулирующая система, образующая такие продукты как ацетон (идет на производство кардита), бутанол (производство искусственной резины — синтетический каучук.

Топливный этанол и бутанол рассматривают как перспективный, возобновляемый вид топлива для двигателей внутреннего сгорания. Данным процессом занимается множество лабораторий по миру, занимающихся разработкой топлива для автомобилей. Так же, рассматривается идея использования в качестве субстрата пищевых продуктов для получения топлива, энергии, поддержания жизни людей. Поэтому, рассматриваются источники возобновляемого сырья — целлюлоза. Целлюлозу гидролизуют до глюкозы и уже после используют раствор глюкозы для производства различных веществ.