bio_2денисенко

Вариант № 2

Вопрос № 1

История развития биотехнологических процессов.

Биотехнология - это наука о методах и технологиях производства различных ценных веществ и продуктов с использованием природных биологических объектов (микроорганизмов, растительных и животных клеток), частей клеток (клеточных мембран, рибосом, митохондрий, хлоропластов) и процессов.

Корни биотехнологии уходят в далёкое прошлое и связаны с хлебопечением, виноделием и другими способами приготовления пищи, известными человеку еще в древности. Например, такой биотехнологический процесс, как брожение с участием микроорганизмов, был известен и широко применялся еще в древнем Вавилоне, о чем свидетельствует описание приготовления пива, дошедшее до нас в виде записи на дощечке, обнаруженной в 1981 г. при раскопках Вавилона. Наукой биотехнология стала благодаря исследованиям и работам французского ученого, основоположника современной микробиологии и иммунологии Луи Пастера (1822-1895).

В ХХ веке происходило бурное развитие молекулярной биологии и генетики с применением достижений химии и физики. Важнейшим направлением исследований явилась разработка методов культивирования клеток растений и животных. И если еще совсем недавно для промышленных целей выращивали только бактерии и грибы, то сейчас появилась возможность не только выращивать любые клетки для производства биомассы, но и управлять их развитием, особенно у растений. Таким образом, новые научно-технологические подходы воплотились в разработку биотехнологических методов, позволяющих манипулировать непосредственно генами, создавать новые продукты, организмы и изменять свойства уже существующих. Главная цель применения этих методов - более полное использование потенциала живых организмов в интересах хозяйственной деятельности человека. В 70-е годы появились и активно развивались такие важнейшие области биотехнологии, как генетическая (или генная) и клеточная инженерия, положившие начало «новой» биотехнологии, в отличие от «старой» биотехнологии, основанной на традиционных микробиологических процессах. Так, обычное производство спирта в процессе брожения – это "старая" биотехнология, но использование в этом процессе дрожжей, улучшенных методами генной инженерии с целью увеличения выхода спирта, - "новая" биотехнология.

За последние 20 лет биотехнология, благодаря своим специфическим преимуществам перед другими науками, совершила решительный прорыв на промышленный уровень. Этим она в немалой степени обязана также развитию новых методов исследований и интенсификации процессов, открывших ранее неизвестные возможности в получении биопрепаратов, способов выделения, идентификации и очистки биологически активных веществ.

Биотехнология формировалась и эволюционировала по мере формирования и развития человеческого общества. Ее возникновение, становление и развитие условно можно подразделить на 4 периода.

1. Эмпирический период или доисторический - самый длительный, охватывающий примерно 8000 лет, из которых более 6000 лет до н.э. и около 2000 лет н.э. Древние народы того времени интуитивно использовали приемы и способы изготовления хлеба, пива и некоторых других продуктов, которые теперь мы относим к разряду биотехнологических. К эмпирическому периоду относятся получение кисломолочных продуктов, квашеной капусты, медовых алкогольных напитков, силосование кормов. Таким образом, народы исстари пользовались на практике биотехнологическими процессами, ничего не зная о микроорганизмах. Эмпиризм также был характерен и в практике использования полезных растений и животных.

2. Этиологический период в развитии биотехнологии охватывает вторую половину XIX в. и первую треть XX в. (1856 - 1933 гг.). Он связан с выдающимися исследованиями великого французского ученого Л. Пастера (1822 - 95) - основоположника научной микробиологии. Пастер установил микробную природу брожения, доказал возможность жизни в бескислородных условиях, создал научные основы вакцинопрофилактики и др.

3. Биотехнический период - начался в 1933 г. и длился до 1972 г. Особенно мощный толчок в развитии промышленного биотехнологического оборудования был отмечен в период становления и развития производства антибиотиков (время второй мировой войны 1939-1945 гг., когда возникла острая необходимость в противомикробных препаратах для лечения больных с инфицированными ранами).

4. Геннотехнический период начался с 1972 г., когда П. Берг создал первую рекомбинацию молекулы ДНК, тем самым показав возможность направленных манипуляцией с генетическим материалом бактерий. Естественно, что без фундаментальной работы Ф. Крика и Дж. Уотсона по установлению структуры ДНК было бы невозможно достигнуть современных результатов в области биотехнологии. Выяснение механизмов функционирования и репликации ДНК, выделение и изучение специфичных ферментов привело к формированию строго научного подхода к разработке биотехнических процессов на основе генноинженерных манипуляций .

Вопрос № 2

Иммобилизованные ферментные системы, способы иммобилизации, организация непрерывных процессов.

Иммобилизированные ферменты (от лат. immobiiis — неподвижный) - это препараты ферментов, молекулы которых связаны с матрицей, или носителем (как правило, полимером), и сохраняют при этом полностью или частично свои каталитические свойства. Иммобилизованные ферменты обычно не растворимы в воде; между двумя фазами возможен обмен молекулами субстрата, продуктов каталитической реакции, ингибиторов и активаторов.

Под иммобилизацией фермента понимается его включение в какую либо изолированную фазу, которая отделена от фазы свободного раствора, но способна обмениваться с находящимися в последней молекулами субстрата или эффектора. Иными словами, иммобилизация представляет собой включение фермента в такую среду, в которой для него доступной является лишь ограниченная часть общего объема. Иммобилизация ферментов – это перевод их в нерастворимое состояние с сохранением (частичным или полным) каталитической активности.

1. В результате иммобилизации ферменты приобретают преимущества гетерогенных катализаторов – их можно удалять из реакционной смеси (и отделять от субстратов и продуктов ферментативной реакции) простой фильтрацией. Этим устраняется первый из перечисленных недостатков растворимых ферментов как технологических катализаторов. Более того, появляется возможность перевода многих периодических ферментативных процессов на непрерывный режим, используя колонны или проточные аппараты с иммобилизованными ферментами.

2. Иммобилизованные ферменты более устойчивы к внешним воздействиям, чем растворимые ферменты. Таким образом, возникли перспективы преодоления и второго недостатка – их лабильности.

3. Принцип иммобилизации был применен не только к ферментам, но и к их субстратам, ингибиторам и кофакторам, т. е. веществам, имеющим избирательное сродство к ферментам. Это позволило создать метод выделения и очистки ферментов, основанный на хроматографии по сродству, или аффинной хроматографии. Тем самым существенно облегчается выделение чистых ферментов, и в настоящее время можно рассчитывать на то, что и третья из отмеченных причин, ограничивающих промышленное применение ферментов, успешно преодолевается.

Существует несколько различных подходов для выбора способов иммобилизации по целям использования в конкретных производственных условиях:

1. Выбор по принципу действия иммобилизованных клеточных систем.

2. Выбор по масштабности биотехнологического процесса.

3. Выбор по специфике биотехнологического процесса.

Выбор по специфике биотехнологического процесса. Единственная область применения иммобилизованных клеток, для которой конкретно указывается наиболее перспективный метод иммобилизации (адсорбционный – очистка сточных вод.

Способы иммобилизации ферментов:

1) путем образования ковалентных связей между ферментом и матрицей;

2) полимеризацией мономера, образующего матрицу, в присутствии фермента, который при этом оказывается включенным в сетку полимера - обычно геля;

3) благодаря электростатическому взаимодействию противоположно заряженных групп фермента и матрицы;

4) сополимеризацией фермента и мономера, образующего матрицу;

5) связыванием фермента и матрицы в результате невалентных взаимодействий - гидрофобных, с образованием водородных связей и др.;

6) инкапсулированием - созданием около молекул фермента полупроницаемой капсулы, например, включением фермента в липосомы;

7) сшиванием молекул фермента между собой, например, глутаровым альдегидом, диметиловым эфиром диимида адипиновой кислоты.

Непрерывный процесс культивирования микроорганизмов обладает существенными преимуществами перед периодическим . Непрерывная ферментация осуществляется в условиях установившегося режима, когда микробная популяция и ее продукты наиболее однородны. Применение непрерывных процессов ферментации создает условия для эффективного регулирования и управления процессами биосинтеза. Системы непрерывной ферментации могут быть организованы по принципу полного вытеснения или полного смешения.

Первый пример – так называемая тубулярная культура. Процесс ферментации осуществляется в длинной трубе, в которую с одного конца непрерывно поступают питательные компоненты и инокулят, а с другой с той же скоростью вытекает культуральная жидкость. Данная система проточной ферментации является гетерогенной. При непрерывной ферментации в ферментах полного смешения (гомогенно-проточный способ) во всей массе ферментационного аппарата создаются одинаковые условия. Применение таких систем ферментации позволяет эффективно управлять отдельными стадиями, а также всем биотехнологическим процессом и стабилизировать продуцент в практически любом, требуемом экспериментатору или биотехнологу состоянии. Управление подобными установками осуществляется двумя способами:

Турбидостатный способ базируется на измерении мутности выходящего потока. Измерение мутности микробной суспензии, вызванное ростом клеток, является мерой скорости роста, с которой микроорганизмы выходят из биореактора. Это позволяет регулировать скорость поступления в ферментер свежей питательной среды.

Хемостатный способ, проще. Управление процессом в хемостате осуществляется измерением не выходящего, а входящего потока. При этом концентрацию одного из компонентов питательной среды (углерод, кислород, азот), поступающего в ферментер, устанавливают на таком уровне, при котором другие питательные компоненты находятся в избытке, то есть лимитирующая концентрация задающегося биогенного элемента ограничивает скорость размножения клеток в культуре. Обеспечение процесса ферментации, с точки зрения инженерной реализации, сводится к дозированному поступлению в ферментер потоков (инокулята, воздуха (или газовых смесей), питательных биогенов, пеногасителей) и отвода из него тепла, отработанного воздуха, культуральной жидкости, а также измерению и стабилизации основных параметров процесса на уровне, требуемом для оптимального развития продуцента и образования целевого продукта. В ходе ферментации образуются сложные смеси, содержащие клетки, внеклеточные метаболиты, остаточные концентрации исходного субстрата. При этом целевые продукты, как правило, находятся в этой смеси в небольших концентрациях, а многие из них легко разрушаются. Все это накладывает существенные ограничения на методы выделения и сушки биологических препаратов

Вопрос № 3

Способы ведения биологических процессов, глубинное и поверхностное культивирование.

Культивирование микроорганизмов можно поводить поверхностным или глубинным, периодическим или непрерывным методами, в аэробных или анаэробных условиях. Большое значение при выборе способа культивирования имеет отношение выбранного культивируемого микроорганизма к молекулярному кислороду и конечная цель культивировании, которой может быть либо накопление биомассы клеток, либо получение определенного метаболита (спирта, кислорода, фермента и т.д).

Поверхностное культивирование.

 При поверхностном культивировании микроорганизмы развиваются на поверхности питательной среды. Среды могут быть плотными, сыпучими или представлять собой тонкий слой жидкой среды. Практически метод применим только для культивирования аэробных микроорганизмов. В этом случае микроорганизмы получают кислород непосредственно из воздуха. Важным условием реализации метода является большая площадь соприкосновения поверхности питательной среды с окружающим воздухом. В жидких средах аэробные микроорганизмы часто растут, образуя на поверхности пленку. Факультативные анаэробы развиваются не только на поверхности, но и в толще жидкой среды, вызывая более или менее равномерное ее помутнение.

Этим методом ранее в промышленных масштабах получали лимонную кислоту и некоторые ферментные препараты для собственных нужд на заводах малой мощности. В настоящее время в промышленности его почти не применяют и подобная технология считается устаревшей. Поверхностное культивирование микроорганизмов используют в основном, в лабораторной практике в научных исследованиях и в музеях чистых культур.

Глубинное культивирование. 

Глубинный метод культивирования является более совершенным по сравнению с поверхностным. При этом микроорганизмы растут и развиваются во всем объеме питательной среды, а не только на ее поверхности. Осуществляют его, применяя жидкие питательные среды. Метод можно использовать как при культивировании аэробов, так и анаэробов.

Совокупность остатков питательной среды, растущих в ней микроорганизмов и продуктов их жизнедеятельности, образующихся при глубинном культивировании, называется культуральной жидкостью.

При культивировании аэробных микроорганизмов необходимо обеспечить большую поверхность соприкосновения питательной среды с кислородом воздуха, так как при глубинном культивировании в жидких средах микроорганизмы используют растворенный в среде кислород. Вместе с тем растворимость кислорода в воде невелика, поэтому для обеспечения роста аэробных микроорганизмов в толще среды, ее необходимо постоянно аэрировать - подводить кислород во всю толщу жидкой среды. В результате питательная среда насыщается кислородом воздуха и создаются благоприятные условия для развития аэробов.

В лабораторной практике способ глубинного культивирования реализуется путем использования специальных установок – качалок, обеспечивающих встряхивание или вращение колб и пробирок со скоростью 100-200 об/мин и более. Чем больше скорость вращения, тем больше поверхность соприкосновения среды с воздухом и выше насыщение ее кислородом. Помимо перемешивания, аэрировать питательную среду можно продуванием (барботированием), через ее толщу стерильного воздуха. Этот способ также используется в лабораторных исследованиях, но особенно широкое применение он нашел в промышленной микробиологии, где его применяют при получении микробной биомассы, в производстве антибиотиков, ферментов, витаминов, кислот. В промышленных масштабах глубинное культивирование осуществляют в специальных аппаратах – ферментаторах.

Ферментатор- представляет собой цилиндрический аппарат со сферическими крышкой и днищем, снабженный мешалкой, отбойниками и устройством для диспергирования стерильного воздуха – барботером. Снаружи ферментатор снабжен рубашкой, в которую подается теплоноситель (обычно это вода) для поддержания в ферментаторе необходимой температуры. Иногда с этой же целью внутри ферментатора устанавливают змеевик.

Глубинное культивирование имеет ряд преимуществ по отношению к поверхностному:

- улучшаются санитарно-гигиенические условия труда;

- сокращаются производственные площади;

- появляется возможность автоматизации технологического процесса;

- удобство выделения целевого продукта из культуральной жидкости;

- возможность осуществления процесса непрерывного культивирования.

Периодическое культивирование. Глубинное культивирование микроорганизмов может быть периодическим и непрерывным.

При периодическом режиме культивирования весь объем питательной среды засевают посевной культурой, и выращивание ведут в оптимальных условиях определенный период времени до накопления нужного количества целевого продукта. При таком режиме в течение всего периода культивирования непрерывно изменяется скорость роста культуры, ее физиолого-биохимические и морфологические показатели. В связи с этим культура в своем развитии проходит несколько фаз роста и размножения, из которых можно выделить четыре основных.