Вариант № 4

Вопрос № 1

Коллекция штаммов продуцентов, хранение и передача штаммов микроорганизмов, правовая защита новых культур.

Формы депонирования микроорганизмов

Под депонированием штамма микроорганизма понимается передача его в коллекцию, регистрация, хранение и выдача образца микроорганизма заинтересованным лицам в соответствии с установленными правилами.  В зависимости от целей осуществления депонирования, в ВКПМ различают следующие  формы (категории) депонирования: хранение,  гарантийное хранение, национальное и международное патентное депонирование. Депонированному штамму микроорганизма присваивается регистрационный номер, использующийся в дальнейшем для его идентификации. 

 Хранение

На хранение принимаются штаммы,  представляющие интерес  для практического применения или для исследовательских целей.

Депонирование осуществляется бесплатно.  Информация о  штаммах, находящихся на хранении, помещается в каталог, а сами штаммы выдаются из коллекции по запросам заинтересованных лиц.

Лицо, передавшее штамм  на хранение,  в последующем имеет право на получение образца сданного штамма из коллекции  бесплатно, а также на оговариваемые льготы в получении других штаммов.

Гарантийное хранение

Проводится с целью обеспечения сохранности  штаммов,  представляющих интерес для депозитора.

Депозитору выдается расписка о приеме культуры на гарантийное хранение по установленной форме.

Коллекция сохраняет конфиденциальность  информации  о  факте депонирования и о депонированном штамме в течение всего срока гарантийного хранения.  Штамм выдается из коллекции  только по письменному разрешению депозитора.

Если в последующем на штамм или способ с  его  использованием подается  заявка на патент,  то по письменному заявлению депозитора штамм может быть переведен на депонирование по форме "патентное депонирование". При этом депозитору  выдается свидетельство о депонировании  по соответствующей форме с указанием даты первоначального депонирования.

Гарантийное хранение осуществляется в течение  срока  оговоренного при депонировании. По желанию депозитора и в случае осуществления соответствующей оплаты, срок гарантийного хранения может быть продлен.

 По истечении установленного срока, коллекция, по письменному заявлению депозитора, возвращает ему депонированный штамм и всю, полученную при депонировании документацию.

Если в течение 6 месяцев по истечении срока гарантийного хранения от депозитора не поступит заявление об изъятии штамма или иное распоряжение, штамм переводится на депонирование по форме "хранение" или уничтожается.

Национальное патентное депонирование.

Осуществляется в случае,  если на штамм или способ с его использованием планируется подать заявку на патент  России.

После проверки чистоты и жизнеспособности поступающего штамма, депозитору выдается справка о приеме культуры на депонирование (справка о депонировании) по установленной форме. С момента выдачи справки о депонировании штамм не подлежит отзыву.

Если в дальнейшем на штамм или способ с  его  использованием подается заявка на патент в других странах, то по письменной просьбе депозитора депонирование переводится в категорию  "международное"  патентное депонирование и депозитору выдается  справка о депонировании по соответствующей форме с указанием даты первоначального депонирования.

До подачи заявки на патент информация о самом факте осуществления депонирования и о депонированном штамме является конфиденциальной и, также как сам штамм, предоставляется  третьим  лицам только с письменного разрешения депозитора.

После подачи депозитором заявки на патент в патентное ведомство РФ образец депонированного микроорганизма  может быть выдан Патентному Ведомству РФ по его запросу при условии, что к этому запросу прилагается декларация, свидетельствующая о том, что в Патентное Ведомство РФ подана заявка на патент, предметом которой является упомянутый микроорганизм или его использование, и что образец и любая информация, прилагаемая к нему или связанная с ним, будут использованы исключительно для целей патентной процедуры.

После публикации сведений о выдаче патента  штамм предоставляется третьим лицам:

а) по письменному разрешению депозитора;

б) по письменному указанию Патентного ведомства РФ после представления  запрашивающей стороной декларации (см. приложение) с обязательством не передавать предоставленный депонированный штамм или любой штамм, полученный от него, третьим лицам, не вывозить за пределы юрисдикции патента и не использовать с целью  получения прибыли (для промышленных целей) в течение срока действия патента без соответствующего разрешения патентовладельца. В этом случае запрос на выдачу штамма должен содержать развернутое пояснение  в рамках выполнения какого именно госзаказа, гранта и т.д. и с какой  целью будут проводиться исследования с запрашиваемым штаммом.

В случае б) коллекция письменно уведомляет депозитора о произведенной выдаче.

Депозитор сообщает в коллекцию информацию о подаче заявки на патент,  о получении патента по заявке или об отказе в выдаче патента,  а также  о прекращении действия патента.

  Если в течение трех лет с момента депонирования в коллекцию не поступила  информация  о  подаче депозитором заявки  на патент (с указанием номера заявки и объекта патентования), а также если по заявке получен отказ в выдаче патента, возможности обжалования которого исчерпаны, то депонирование переводится в категорию "хранение" или, по просьбе депозитора, в категорию "гарантийное хранение" (но без права отзыва штамма).

По письменному заявлению депозитора, поступившему в ВКПМ до истечения указанного срока (т.е. 3х лет с даты депонирования), и при условии оплаты соответствующего тарифа срок содержания штамма микроорганизма в соответствии с правилами национального патентного депонирования может быть продлен

После публикации сведений  о  выдаче  патента  информация  о штамме может быть внесена в каталог микроорганизмов,  хранящихся в ВКПМ с указанием номера патента.

В случае утери жизнеспособности штаммом,  депонированным  по форме "национальное патентное депонирование" депозитор имеет право осуществить повторное депонирование штамма в коллекции. 

По окончании срока действия  патента, а так же если действие патента прекращено и не подлежит восстановлению,  микроорганизм переводится на депонирование по форме "хранение" и в каталог вносится соответствующее изменение.

Международное патентное депонирование

Осуществляется в случае, когда изобретение патентуется кроме России и  в  других странах.

После проверки чистоты и жизнеспособности поступающего штамма депозитору выдается справка о депонировании  и свидетельство о жизнеспособности сданного штамма по установленной международной форме на английском языке.

До подачи заявки на патент информация о самом факте осуществления депонирования и о депонированном штамме является конфиденциальной  и предоставляется  третьим  лицам только с письменного разрешения депозитора.

После подачи депозитором заявки на патент в  патентное  ведомство штамм предоставляется лицам, имеющим на это право (Инструкция к Будапештскому договору о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры)

 и при  соблюдении  требований,  которые  предусмотрены этим правилом.  При  этом коллекция в письменной форме  уведомляет депозитора о произведенной выдаче (кроме случая, когда выдача осуществляется с разрешения депозитора).

После публикации сведений  о  выдаче  патента,  информация  о штаммах, депонированных в ВКПМ по форме "международное патентное депонирование",  вносится в Каталог микроорганизмов,  хранящихся в ВКПМ, по просьбе депозитора.  Однако,  в любом случае в Каталог могут быть внесены сведения о всех микроорганизмах, которые или использование которых является предметом опубликованных патентов РФ.

В случае утери жизнеспособности штаммом,  депонированным  по форме "международное  патентное  депонирование"  депозитор  имеет право осуществить повторное депонирование штамма в коллекции.

Микроорганизмы, сданные на депонирование по форме "международное патентное депонирование" хранятся в течении по меньшей мере пяти лет с момента последнего запроса о выдаче образца депонированного микроорганизма и в любом случае не менее 30 лет с даты депонирования.

Вопрос № 2

Воспомогательные биотехнологические процессы: сепарация, дезентигрирование клеток, плазмолиз, экстракция и сушка, особенности проведения этих процессов в биотехнологии.

Культуральная жидкость представляет собой сложную смесь, содержащую микробные клетки, продукты метаболизма, остатки компонентов питательной среды, пеногаситель. Технология получения продуктов микробного синтеза из культуральной жидкости зависит от происхождения и товарной формы биопрепарата.

Различают следующие группы препаратов:

1 на основе инактивированной биомассы клеток (кормовые препараты белков, аминокислот, антибиотиков и т. д.),

2 на основе очищенных продуктов метаболизма микроорганизмов (ферменты, антибиотики, витамины, органические кислоты и др.),

3 препараты в виде жизнеспособных микроорганизмов (бактериальные удобрения, средства защиты растений, закваски и др.).

Товарными формами биопрепаратов являются жидкие концентраты (45–50% сухого вещества), пасты (20–40% влаги), кристаллические вещества (1,5–5,0% свободной влаги), сухие порошкообразные и гранулированные продукты (8–11% влаги). Себестоимость жидких концентратов и паст значительно ниже, чем сухих продуктов.

Низкая концентрация биомассы и метаболитов в культуральной жидкости обусловливает необходимость проведения ряда последовательных операций по концентрированию и очистке целевого компонента. Количество операций возрастает с повышением требований к чистоте продукта.

В большинстве производств переработка культуральной жидкости начинается с отделения микробной массы. Для этого применяют осаждение в поле центробежных сил (сепарацию, центрифугирование); фильтрование; флотацию; обработку культуральной жидкости коагулянтами (FeCl3, Al2(SO4)3), флокулянтами полисахаридной природы или синтетического происхождения (высокомолекулярными полиэлектролитами), гелеобразующими агентами (суспензия Ca(OH)2 + H3PO4) с последующим отделением осадка фильтрованием.

Обработка микробной суспензии коагулянтами, флокулянтами, гельобразующими агентами позволяет не только дестабилизировать биоколлоидную систему и осадить клетки, но и очистить в определенной степени содержащую целевой метаболит межклеточную жидкость от балластных примесей (белков, красящих веществ и др.).

Фильтруемость культуральной жидкости зависит от ряда факторов: вида микроорганизма-продуцента (размера и структуры клеточных образований), состава питательной среды и степени потребления компонентов, длительности ферментации. Присутствие в значительном количестве неассимилированных питательных веществ, жиров, применяемых в качестве пеногасителя, а также лизис клеток в результате продолжительного культивирования негативно влияют на скорость фильтрования.

Широкое распространение получил сепарационный метод концентрирования микробных (прежде всего дрожжевых) суспензий, который позволяет с высокой скоростью обрабатывать большие объемы труднофильтруемой культуральной жидкости.

Флотационный способ сгущения дрожжевой суспензии, при котором концентрирование дрожжей достигается за счет перехода клеток в пену в результате продувки суспензии мелкодиспергированным воздухом. Флотационный способ концентрирования дрожжей имеет ряд преимуществ перед сепарационным: простота и доступность оборудования, низкие энергозатраты на процесс, повышение качества продукта благодаря отделению нефлотирующихся примесей. Однако не все дрожжевые культуры обладают достаточной флотационной способностью, которая зависит от физиологических особенностей штамма и химического состава культуральной жидкости.

При производстве биопрепаратов на основе инактивированной биомассы клеток широко используют упаривание культуральной жидкости в трех-, четырехкорпусных выпарных установках до содержания сухих веществ в концентрате 20–45%. Целевые продукты микробного синтеза термолабильны, поэтому упаривание осуществляют под разрежением и при режимах, обеспечивающих минимальные потери биологической активности продуктов. Как правило, температура кипения жидкости в первом корпусе выпарной установки составляет 80–85С, в последнем – 50–55С. Наибольшее распространение получили трехкорпусные выпарные установки со стекающей пленкой, которые отличаются компактностью, высокой производительностью по испаряемой влаге и небольшим временем пребывания упариваемой жидкости в аппарате.

Целевыми продуктами микробного синтеза могут быть внутриклеточные биополимеры (нуклеиновые кислоты, белки, липиды), а также эндометаболиты (антибиотики, витамины, ферменты). Некоторые компоненты можно извлечь без предварительного разрушения клеточной стенки (например, экстракцией), в других случаях (для выделения внутриклеточных биополимеров) требуется дезинтеграция клеточной массы, которую осуществляют различными методами. При химической дезинтеграции клеточную суспензию обрабатывают аген- 58 тами (щелочью, глицерином, толуолом, пероксидом водорода), которые повышают проницаемость клеточных стенок. Биологические способы разрушения оболочки основаны на действии собственных гидролитических ферментов (автолиз) или специальных ферментных препаратов (лизоцим, зимолиаза и др.). Наибольшее промышленное значение имеют физические методы, которые более экономичны, чем химические и ферментативные. Чаще всего применяют обработку клеточной массы ультразвуком. Могут быть использованы такие приемы, как растирание с кварцевым песком, замораживание – оттаивание, продавливание массы через узкие отверстия под высоким давлением, декомпрессия (сжатие клеточной суспензии с последующим резким снижением давления). Фрагменты клеточных стенок отделяют центрифугированием или фильтрованием.

Выделение целевых компонентов из сложной смеси дезинтегратов клеток – трудоемкий и дорогостоящий процесс, который целесообразен в производстве только очень ценных биологически активных веществ. В биотехнологии предпочтение отдают использованию штаммов микроорганизмов, экскретирующих целевой компонент. В этом случае технология получения чистых препаратов существенно упрощается.

Распространенными промышленными методами выделения экзометаболитов из культуральной жидкости являются ионный обмен с использованием сухих и жидких ионообменных смол – катионитов и анионитов (производство аминокислот), экстракция органическими растворителями (производство антибиотиков), осаждение из растворов солями и органическими растворителями (ферментные препараты), кристаллизация (витамины, антибиотики, аминокислоты). Выделить целевой продукт с высокой степенью чистоты одним способом практически невозможно. В производственных условиях применяют комбинации различных методов.

Для обезвоживания живых микроорганизмов (а также концентрата высокоактивных термолабильных метаболитов) наиболее пригодна сублимационная сушка, т. е. высушивание материала из замороженного состояния при температуре не выше 28С без оттаивания при глубоком разрежении (влага переходит из твердого состояния в газообразное, минуя стадию жидкой фазы). Сублимационной сушке подвергают концентрат суспензии микроорганизмов, в который предварительно вводят криозащитные вещества, например, глицерин, мелассу, раствор глюкозы. Криопротекторы предотвращают механическое повреждение клеточных структур кристаллами льда и концентрирование внутриклеточных электролитов, вызывающих денатурацию белка. На выживаемость клеток большое влияние оказывают скорость замораживания и остаточная влажность препарата, которые уточняют для данного объекта экспериментальным путем. Сублимационная сушка – энергоемкий и дорогостоящий процесс, но в производстве ряда биопрепаратов (прежде всего для медицинских целей) она незаменима. В крупнотоннажных производствах сушку концентрированных суспензий микроорганизмов производят в высокопроизводительных распылительных сушилках при прямом контакте диспергированной до капелек суспензии с горячим воздухом или топочными газами от сжигания природного газа. Температура сушильного агента на входе в сушилку колеблется в пределах 120–350С в зависимости от термоустойчивости продукта. Короткое время сушки (5–25 с) и низкая температура высушиваемого продукта (не более 45С) позволяют избежать существенных потерь биологически активных веществ и использовать метод для сушки термолабильных продуктов, в том числе ферментных препаратов.

Если растительную клетку поместить в гипертонический раствор, растительная клетка теряет воду и, следовательно, тургорное давление из-за плазмолиза: давление снижается до точки, когда протоплазма клетки отслаивается от клеточной стенки, оставляя зазоры между клеточной стенкой и мембраной. и заставляет растительную клетку сжиматься и сморщиваться. Продолжающееся снижение давления в конечном итоге приводит к циторризу - полному разрушению клеточной стенки. Растения с клетками в таком состоянии увядают. После плазмолиза промежуток между клеточной стенкой и клеточной мембраной в растительной клетке заполняется гипертоническим раствором. Это связано с тем, что, поскольку раствор, окружающий клетку, является гипертоническим, имеет место экзосмос, и пространство между клеточной стенкой и цитоплазмой заполняется растворенными веществами, поскольку большая часть воды уходит, и, следовательно, концентрация внутри клетки становится более гипертонической. В растениях есть некоторые механизмы, предотвращающие чрезмерную потерю воды так же, как и избыток воды. Плазмолиз можно обратить вспять, если поместить клетку в гипотонический раствор. Устьица помогают удерживать воду в растении, чтобы оно не пересыхало. Воск также удерживает воду в растении.

Плазмолиз может быть двух типов: вогнутый плазмолиз или выпуклый плазмолиз. Выпуклый плазмолиз всегда необратим, в то время как вогнутый плазмолиз обычно обратим. Во время вогнутого плазмолиза плазматическая мембрана и замкнутый протопласт частично сжимаются от клеточной стенки из-за полусферических, направленных внутрь изогнутых карманов, образующихся между плазматической мембраной и клеточной стенкой. Во время выпуклого плазмолиза плазматическая мембрана и заключенный в нее протопласт полностью сжимаются от клеточной стенки, при этом концы плазматической мембраны образуют симметрично сферически изогнутый узор.

Вопрос № 3

Очистка сточных вод, метановое брожение.

Очистка сточных вод — комплекс мероприятий по удалению загрязнений, содержащихся в бытовых и промышленных сточных водах  перед выпуском их в водоёмы. Очистка сточных вод осуществляется на специальных очистных сооружениях.

Процесс очистки имеет 4 этапа:

1 механический

2 биологический

3 физико-химический

4 дезинфекция сточныхвод