23. Реакция непрямой гемагглютинации

В некоторых случаях комплекс антигенов с антителами не виден

невооруженным глазом. В таких случаях антигены адсорбируют на более крупных

частицах-носителях (эритроцитах, частицах латекса), получая антигенный

эритроцитарный диагностикум. Последующая агглютинация специфическими

антителами таких частиц позволяет видеть агглютинат невооруженным глазом.

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА) выявляет антитела

сыворотки крови с помощью антигенного эритроцитарного диагностикума, который

представляет собой эритроциты с адсорбированными на них антигенами.

Эритроциты с адсорбированными на них антигенами взаимодействуют с

соответствующими антителами сыворотки крови, что вызывает склеивание и

выпадение эритроцитов на дно пробирки или ячейки в виде фестончатого осадка.

При отрицательной реакции эритроциты оседают в виде пуговки.

РНГА ставят в пластиковых планшетах или в пробирках с разведениями

сыворотки крови, к которым добавляют эритроцитарный диагностикум.

Иногда применяют антительный эритроцитарный диагностикум – эритроциты,

на которых адсорбированы антитела. Такую реакцию называют РОНГА – реакцией

обратной непрямой гемагглютинации.

Постановка РНГА микрометодом капельным способом.

Компоненты реакции:

- фосфатный буферный раствор (рН 7,2);

- сыворотка крови больного сыпным тифом (разведение 1:25);

- сыпнотифозный эритроцитарный диагностикум (эритроциты, нагруженные

антигеном риккетсий Провачека);

- промывной раствор.

В семь лунок планшета для иммунологических исследований внести по две

капли фосфатного буферного раствора. В первую лунку прибавить две капли

сыворотки крови больного сыпным тифом, после чего из первой лунки перенести 2

капли во вторую лунку, из второй – в третью и т. д. Из шестой лунки 2 капли

удалить. Во все семь лунок (6 опытных и 1 контрольную) прибавить по 2 капли

эритроцитарного диагностикума. После каждой операции необходимо промывать

пипетку в промывочном растворе. Планшеты оставить при комнатной температуре

на 45 минут, после чего учесть результаты.

24. Реакция связывания комплемента

Реакция связывания комплемента заключается в том, что при соединении

антигена с антителом образуется иммунный комплекс, к которому через Fc-

фрагмент антител присоединяется комплемент. Если комплекс антигена с антителом

не образуется, то комплемент остается свободным. Свободный комплемент

выявляется добавлением к смеси гемолитической системы, состоящей из

эритроцитов барана и антител против них. Положительная реакция – отсутствие

гемолиза в результате связывания комплемента с комплексом антиген+антитело.

Отрицательная реакция – наличие гемолиза в результате связывания комплемента с

комплексом эритроцит+антиэритроцитарное антитело.

РСК отличается высокой чувствительностью и специфичностью и применяется для; 1) серологической диагностики инфекционных заболеваний (р. Вассермана — при сифилисе, р. Борде-Жангу — при хронической гонорее и др.); 2) идентификации бактерии и др. микробов. РСК относится к сложным серологическим реакциям, в которых участвуют, кроме АГ- АТ-, ещё гемолитическая система (р. гемолиза), выявляющая результат реакции.

РСК проводится в два этапа при участии двух систем: 1) Первая система — АГ+АТ-(-комплемент — обуславливает связывание комплемента в том случае, если АТ соответствует АГ, В случае же несоответствия АТ и АГ комплемент остаётся свободным; 2) Вторая система (индикаторная) — гемолитическая сыворотка (гемолизины) + эритроциты — показывает исход реакции в первой системе: в случае положительного результата реакции в первой системе (образования комплекса АГ+АТ+комплемент) во второй системе не произойдет гемолиза ввиду отсутствия комплемента (эритроциты оседают на дно пробирки). В случае отрицательного результата в первой системе вторая сопровождается гемолизом, т.к. образуется комплекс эритроциты + гемолизины + комплемент.

Постановка РСК.

Компоненты реакции:

- сыворотка крови здорового донора;

- сыворотка крови больного гонореей (в разведении 1:5);

- лизат гонококков (антигенный компонент реакции - инактивированный

возбудитель гонореи);

- комплемент в разведении, соответствующем рабочей дозе. Комплемент

получают из сыворотки крови морской свинки. Титром комплемента является его

минимальная доза, которая в присутствии гемолитической сыворотки вызывает

4

полный гемолиз эритроцитов. Рабочая доза комплемента, используемая при

постановке РСК, на 30% больше его титра;

- гемолитическая система - взвесь эритроцитов барана, обработанных

кроличьими антителами к эритроцитам барана.

- промывочный раствор.

РСК ставят в двух пробирках – опытной и контрольной. В опытную пробирку

внести 0,5 мл сыворотки крови больного гонореей, в контрольную внести 0,5 мл

сыворотки крови здорового донора, в обе пробирки внести по 0,5 мл лизата

гонококков, а также по 0,5 мл комплемента. После каждой операции необходимо

промывать пипетку в промывочном растворе. Пробирки поместить в термостат при

температуре 37°С на 30 минут. После инкубации в обе пробирки внести по 1,0 мл

гемолитической системы. Пробирки встряхнуть и поместить в термостат при

температуре 37°С на 30 минут. При положительной реакции в опытной пробирке

отмечают задержку гемолиза (жидкость бесцветная и осадок эритроцитов), в

контрольной пробирке – гемолиз эритроцитов.

Степень интенсивности реакции оценивается, четыре плюса (++++), три (+++) два (++) и один (+)