Летние практики_ocred

ем питательной среды дистиллированной водой в два раза.. Рекоменн-

дуемая температура содержания культурры в лабораторных условиях

24+=± 2°оС.

Выполнение работы по оценке морфологических нарушений у

ряски

1. Отобрать 20 растений LЁ.. minorттог cс дочерними листецами.

2. Приготовить растворы хлорида кадмия в питательной среде в

концентрациях 0,0005, 0,005 и 0,05 мг/л и разлить в три чашки Петри

по 20 млл. В четвертую чашку налить чистую питательнульную среду. 3. Поместить по пять растений в каждую чашку..

4. Оценить коэффициент роста. Для этого провести подсчет листе-

цовнана3,3,5, 7, 10 и 14 сугткии. Обладая мгновеннымростом,,ряска в пер- вые дни набирает максимальныйтемп ростаста.

5. Провести учет морфологических отклонений::

хлорозыы—– потеря пигмента (листецыстановятся желтыми); некрозы —– локализованные отмершие области ткани (коричневые

или белые):;

подсыханиеи (или) увядание листецов;

наличие или отсутствие корней.

6. Для определения концентрации хлорида кадмия, вызывающей

токсическое действие (А), рассчитать среднее значение коэффициента роста по формуле

А = (XХk-XХИХo)/X,k •* 100%,

−— где Х,‚к –- коэффициент роста в контроле, Х,о -– коэффициента роста в тестируемой водной вытяжке. При А ≤< 100% тестируемая среда не- токсична, при 4>А≥ 50% тестируемая среда вызывает острое токсичное

действиествие..

7. Полученные результаты проанализировать с помощью статисти- ческих программ для выявления токсического эффекта от воздействия хлорида кадмия.. 20%--ное отклонения от контроля указывает на высоо- кую токсичность вещества для ряскии.

30

2.3. Оценка степени антропогенной нагрузкина гидросферу по морфометрическим изменениям у инфузории Spirostomum5рй’о5ютит атЫambiguumгиит

Развитие современнн ых эколого-ббиологических знаний базируется на совершенствовании методологии исследований. Последнее десяти- летие развитие биологии характеризуется расширением применения принципов и методов смежных наук, широко использующих матемаа- тические и количественные подходы.

В данной работе предлагается разработаннанный авторами автомати-

зированный метод анализа реакции простейших на воздействие внеш-

них факторов [5|5]. Метод основан на компьютерной прижизненной морфометрии изменения формытела у одноклеточных гидробионтов инфузорий S5.. ambiguumатЫиит, длительно находящихся в низкоинтенсивном электромагнитном поле (ЭМП))с частотой мобильной связии..

Среди множества экологических факторов, воздействующихна ор- ганизмм, ЭМИ занимает значительное место. Распространение подвиж- ной радиосвязи, в том числе сотовой телефонии, привело к массовому приближению источников электроомагнитнных полей (ЭМП))к местам постоянного проживания населения. В Санитарных нормах и прави- лах при работе с источниками ЭМП,,защитынаселения от воздействия ЭМПи других нормативных документах воздействия радиочастотноо- го (РЧ)-излучения (300 МГц −- 300 ГГцц) нормируют по плотности по- тока энергии (ГОСТ 12.1.006-84). В 2003 г.. в РФ введеныв действие санитарно-эпидемиологические правила и нормативы СанПиН 2.1.8/2.2..44..1190-03, которые устанавливаюют для радиочастотных воз-

действий самое жесткое в мире предельно допустимое среднее значе-

ние плотности потока энергии (ППЭ) −— 10 мкВт/см”2 на частоте 900 −—

1800 МГц для поглощенной всем телом мощности потока энергии

(SAR)ЗАК 44 мВт//кг. Эти нормативы основаны на наблюдениях, провее- денных с участием немногочисленных добровольцев, а также в моо- дельных опытах на теплокровных животныхых, отдельно культивируее-

мыхклетках, низших животныхи растениях.

Для создания низкоинтенсивного радиочастотного (900 МГцГц) поля в лабораторных условиях предлагаем использовать лабораторнуторную

31

установкуу, в которой применен серийный маломощныйгенератор ти- па Р2-52 (ОООО «Приборэлектро», Москва, Россияя) и антенна (плоская в виде арифметической двухзаходной плоской спирали диаметром 11ИП см либо рупорная с диаметром раскрыва 25х25 см)). Антенна кре- пится на открытом торце коаксиального четвертьволнового резонато- раа. Преимущества первой антенныв том, что она обладает круговой поляризацией,,т.те.е. вектор ЁЕ перпендикулярен оси излучения и вращаа- ется вокруг неёѐ с частотой излучения. Преимущества второй антенны заключаются в направленном излучениии. Калибровочные измерения ППЭ следует провести с помощью специальных измерительных при- боров, например, приемников ПЗ3-18 или ПЗЗ-54 (Россия), чувствитель- ность которых составляет 0,03 мкВт//см’2. Погрешность измерения ППЭ не превышает обычно 15 −— 20%. В предлагаемой лабораторной

установке величину [ППЭШП в области образца можно регулировать из-

менением расстояния от антенны. На предметном столике установки, где располагаются образцы, снижение уровня ШТППЭ от центра к краю не превышает 10%, что обеспечивает равномерное облучение тест- организмов. Для устранения излучения за пределы установки узел с

антенной и образцом располагаюют на панели из поглощающего в диа-

пазоне радиочастот материале с коэффициентом отражения 0,11.. Раз- мер панели 20х20 см обеспечивает отсутствие ЭМПнанарасстояст нии 1 м

от антенныперпендикулярнорпендикулярно кебеѐ оси.

Культивирование инфузорий S»5.. аmbiguumтб1еиит осуществляют в массо- вой культуре с плотностьью посадки 30 −— 50 особей/мл в биологичее- ских пробиркахс 15 мл воды. Воду для культивирования можно брать из водопровода и дехлорировать отстаиванием в открытых сосудах не менее трех суток. Затем воду дважды профильтровать через обеззо- ленный фильтр (белая лента)). Кормить инфузорий следует суспензией

пищевых дрожжей в концентрации 0,5 мг/мл одинраз в неделю.. Кульь-

туру простейших необходимо поддерживать в логарифмической фазе роста путем еженедельных разбавлений суспензии культуральной во- дой 1:1.. В таких условиях спиростомомы размножаются вегетативно де- лениемна две дочерние клеткираз в двое −— трое суток.

32

Для облучения инфузорий можно отбирать из массовой культуры независимо от сроков кормления. Облучение следует проводитьв от- крытых пластиковых чашках Петри диаметром 3,5 см в объеме воды 4 мл (ввысота водяного столба 0,5 см)). Частоту облучения менять в за- висимости от целей и задач исследования. Основным условием облу-

о

чения является температура 20 −— 22 °С и удаленность от прямых сол- нечных лучей и отопительных приборов. Чашки Петри с контрольны-

ми образцами следует держатьв тех же условиях,,но не облучать..

Выполнение работы по оценке морфометричеч ских нарушений у инфузорий

1. Отобрать 20 инфузорий с помощью пластиковой пипетки и по- местить по пять особей в пластиковые чашки Петри диаметром 3 см в

4 мл культуральнойральнойводы..

2. Облучить на установке, генерирующей электромагнитное излу- чение с параметрами сотовой связи первую группу –- 10 мин, вторую группу -– 20 мин, третьью группу –- 30 мин, четвертую группу не облу- чать, а использовать в качестве биологического контроля.. После об- лучения чашки Петри культивироватьв темноте.

3. Измерение морфологических показателей провести через сутки

после облучения сканирующим способом по всей чашке Петри с по- мощью микроскопа МБС--10 при небольшом увеличении х22.. На микк- роскоп вмонтирована система видеонаблюдения, состоящая из цифроо- вой видеокамеры, например, MYscopeМУзсоре 300 MМ 3 Mpix,Мрх USBЗВ 2.0 (\WEBBERS)УЕВВЕЕ$)(рис( . 9)). Фиксированные изображения получают на мо- ниторе компьютера PentiumРепйит 1..5G5, который обеспечен программой ScopePhotoЗсореРвофю для обработки изображений.

4. Анализ изображений провести в программе «ImageПтазе-РгоPro 3.5» для каждой контрольной и облученной инфузории по четырем из шестнана- дцатии, заложеннымв программу критериямм..

В норме инфузории S5.. ambiguumат\виит имеютв длину1 –- 3 мм, в ширину 0,1 –— 0,5 мм (рисс. 10 а)). После 1-ччасового нахождения в ЭМПу инфуу-

зорий зафиксированы«вертячки« »(» рис( ..10 б6) и «сжатияия»(» рис( ..10 в)).

>33>

Рис.. 9. Система видеонаблюдения и интерфейс программраммы ImegProПпе?Рто для анализа видеоизображения морфометрических изменений мелких лаборатор- ных животных (простейшихи беспозвоночныхх)

Рис.. 10. Морфология тела спиростом: а) физиологичесч кая норма,6), б вертяч- кии ив)в сжатия

В качестве количественных показателей анализируют следующие отклонения от морфологической нормыы:: отношение минимальногмальноо и максимального диаметров (Aspect),Азрес®, длина тела инфузории (DiametrРлатей (mтах)),. периметр (Perimeter)Рептеег и отклонение от окружности (Roundness)Коипдпе$$). На рисунке 11 показаны диапазоныизменения этих параметровв кон- трольной выборке спиростом (контрольь) и после 1-ччасового облучее- ния (опытт) [5].

34

ствия от ЭМП сотовой связи на простейших. 20%-ное отклонение от нормыуказывает на высокую токсичность облучения для инфузорийорий.

2.4. Применение клеточного МТТТ-тест- а для анализа нарушения метаболической активности ветвистоусысых

ракообразных РарйшаDaphnia тагпаmagna

Для анализа цитотоксичности физических и химических факторов окружающей среды применяют методод, в котором используют водо- растворимый 3-(4,5-димет- тилтиазол-2-ил)--2,5.5-дифе- нил-2Н--тетразо- лиум бромид (МТТТ) [3]. МТТ--метод интегрально отражает количество активных форм кислорода,,в том числе, короткоживуущих супероксид- анион-радикалов, инактивациацию сукцинатдегидрогеназ и других мито- хондриальных оксидазаз, соотношение живыхи мертвых клеток и рабо- ту системемы антиоксидантных ферментов. Метод основан на способноо- сти митохондриальных дегидрогеназ восстанавливать проникающийв клетки бесцветный МТТТс образованием нерастворимого окрашенного формазана. Последуюдующщий фотометрический анализ позволяет сопо- ставить изменение оптической плотности раствора по отноношению к контроллю с изменением количества жизнеспособных клеток и оценить эффективностноь цитотоксического действия анализируемого соединее-

нияНИЯ.

Выполнение работы по оценке нарушения метаболической ак- тивности у дафний

1. Растворить 10 мг МТТТв 2 мл водопроводной дехлорированной воды (5 мгг/мл)). Тщательно перемешать (с помощью магнитной мее- шалки) 1| ч в темноте и поместить в термостат на 15 −— 20 мин(37 о°С)). Отфильтровать раствор через мембранный фильтр с диаметром

22 мкм под давлением (водяным или масленыеным насосом)).. Разлить на

аликвотыпо 1| мл в эппендорфыы. Хранить при −—20 °ºС..В качестве рас- творителя формазана использоватьдиметилсульфоксид (ДМСО).)

Для проведения измерения потребуютсяэппендорфынана1,5, млл, ав- томатические микропипетки, наконечники для микропипеток, гомоге- низаторы и 96-луночный планшет, планшетный иммуноферментный

36

анализатор, например, StatЗа FaxЕах 2100 −— AwarenessА\хагепе$$ TechnologyТесбпо]осу, США. VISУ\У!5--модель(рис(рис..12)).

Рис. 12. Планшетный иммуноферментныйанализатор StatЗа FaxЕах 2100

2. В четыре биологические пробирки с 15 мл культуральной воды

отобрать по 20 дафний односуточного возраста. Облучить каждый об-

разец на источнике γу-квантов в однойизиздоз:: 0,1; 1 и 10 Грр. Контрольь-

ную пробиркувсегда держать в тех же условиях,,что и опытные,,но не облучать.

3. После облучения пересадить дафний в стеклянные лабораторные стаканысо 150 мл культуральной среды. Все подписать.

4. После облучения культивировать трое —– четверо суток в климаа- тостате при освещении 12 ч/12 ч свет.:тьма, температуре 20 о°С и по-

стоянном вентилировании.

5. По истечении времени инкубации пересадить дафний из каждой дозовойи контрольной групп в эппендорфы(1,(1,5 мл))..

6. Откачать воду из каждой пробы и тут же добавить по 200 мкл раствора МТТ.

7. Инкубировать не менее 60 мин при комнатной температуре без дополнительной аэрации.

8. По истечении времени инкубации откачать МТТ и добавить по 200 мкл ДМСО. Выдержать 10 мин до растворения гранул формазанаана.

9. Гомогенизировати ов ь пробы до состояния суспензии гомогенизато- ром для эппендорфов, не забывая менять гомогенизаторы между об- разцамии.

37

−— где ОПоO –- оптическая плотностьв облученном образцеце; ОПф —–

средняя оптическая плотность фоновых проб; ОП‚к-– оптическая плот- ность в необлученном контроле.

15. Полученные результаты проанализировать с помощью стати- стических программм для выявления уровня радиационного воздей- ствия. 20%--ное отклонения от нормыуказывает на высокую токсич- ность облучения для дафний.

Литература

1. Биологический контроль окружающей среды:: биоиндикация и

биотестирование:: уч. пособие для студентов вузов / Под редд. ОП.П. Мее-

леховой и Е.И.. Сарапульцевой.. Изд..3-3е-е. дополн..и испр. -—– М.:.: Акадее- мия, 2010. 288– с.

2. Левич А..П.., Булгаков Н..Г. Информационнно-аналитическа- я си-

стема «Экологический контроль природной среды по данным биоло- гического и физико-химического мониторинга»». OnОп-Ппеline доступ http://ecogradeр://есоста4е.61bioо.msuтзи.ru/indexги/ш4ехПит.html

3. Сарапульцева Е.И.., Рябченко Н..И.., Иголкина Ю.В.В.,. Иванник Б.П. Использование клеточного биохимического метода для биотести-

рования inт vivoуй?о радиационного загрязнения окружаюющей среды// Ра-

диационная биология.. Радиоэкологияогия, 2013.. Т.. 53.. №66.. С.634-638..

4. Тирас Х..П.., Асланиди К.Б. Тест-система для неклинического

исследования медицинской и экологической безопасности на основе

регенерации планарий:: учебб.-метод. пособие. –- Тула:: ТулГУ, 2013..-–

64с..

5. Ускалова Д..В.., Баранова М..М.,. Сарапульцева Е.И.., Иголкина

Ю..ВВ. Применение метода компьютерной морфометрии в исследова-

нииНИИ биологического действия низкоинтенсивного рарадиочастотного излучения на простейших // Биомедицинская радиоэлектроника, 2013,

№33. С.48-522.

6. Цаценко Л.В. Обнаружение ионов тяжелых металлов в воде мее- тодом аналитического биотестирования с помощью ряски малой

(LemnaГетпа minorттог LГ..) / Труды Кубанского государственного аграрного

университета, 2014. № 48. С. 106-1133.

39