Летние практики_ocred

контролемем..В эту чашку Петри налить чистую культуральнуую водуу. В чашки Петри налить по 20 мл готовыхрастворов.

4. Перенести по пять планарий с помощью пластиковых пипеток (или кисточки для красок) в каждую чашку Петри, начиная с кон- трольной и далее по градиенту увеличения концентрации вещества..

5. Сверху половину чашки Петри прикрыть бумагой и поставить под интенсивное освещение лампы дневного света. В течение 1| ч наблюдать двигательнуельную активность планарий, фиксируя их располо- жение в экспериментальном поле. Данные заносить в таблл. 2 через

каждые 15 мин.

Таблица 2

Количество планарийв разных экспериментальныхыхзонахах чашки Петт-

ри в контролеи ив воде, загрязненной кадмием в концентрации ___мг/л

6. Через 1 ч наблюдения переместить планарий с помощью пипетт- ки из чашки Петри на чистое предметное стекло в небольшую каплю воды, поставить на поддон со льдом для снижения подвижности жии- вотных и приступить к процедуре декапитации.

Оптимальным инструментом для операций на планариях являются глазные скальпели. Их следует регулярно точить на алмазном камне и править на кожаном ремне. Однако поскольку тело планарий покрыто эпителиемм, операции на них можно проводить любым стеклянныклянным или

металлическиким ножом, обломком лезвия безопасной бритвы и т.д..

20

Единственныенным требованием является достаточно маленькая (не более

2−-3 см) режущая поверхность скальпеля или ножа.

Операции на планариях проводят в нестерильных условиях и без применения специальных анестетиков. Планарии очень подвижны,,и практически невозможно полностью их обездвижить химическими

препаратами.. С другой стороны, помещение планарийв некий раствор для обездвижения неизбежно приведет к тому, что он попадет на ра-

невую поверхность после операции.. Это станет нежелательныльным арте- фактом, влияющим на регенерацию, и может особо негативно отра- зиться на ходе экспериментов с действием внешних химических сти-

муляторов морфогенеза.

Проверенным и эффективным естественныественным фактором торможения подвижности планарий является низкая температура [4]. Поэтому в

ряде случаев во время сложной операции (например, по удаленинию

глотки) животных помещаютна кусочек пищевого льда и далее через разрез на спинной поверхности тела проводят удаление глотки в тече- ние 1| −— 1,5 минут.

Перед операцией надо протереть спиртом операционную пластин- ку, шпатели, скальпели. При этом надо помнить, что спирт очень ток- сичен для планарий и следует оставить инструментыына воздухе, что- бы выветрились остатки спирта со стальных и стеклянных поверхно- стей. В ходе операции и во время экспериментов с регенерирующими животными нужно регулярно протирать все инструменты и операци- онную поверхность фильтровальной бумагой от слизи. Особо надо протирать приспособления для переноса планарий, на кончике кото- рых всегда налипает слизь и частицыгрязи из средыдля культивиро- вания, или регулярно менять одноразовые пластиковые пипетки. Для этого применяются маленькие бумажные тампоны, которые вставля- ются в кончик трубки пинцетомм.

7. Декапитацицию проводить под микроскопом МБС--10 (бинокуляр- ная лупаа) с увеличением не более х2. Одним движением скальпеля

сделать аккуратнытный срез в районе «глаз» планарийй.. После этого жии-

вотных поместить в исследуемые растворы кадмия на четыре -– пять

дней для наблюдения за их регенерационной активностью..В этот пе-

21

зрения бинокуляра в чашках Петри диаметром 15 см или на предметт- ное стекло в каплю воды.

Для освещения контуров тела планарии применяют косое освещее-

ние снизу. Для этого перед началом регистрации следует подобрать угол наклона зеркала бинокуляра для получения наиболее подходящее-

го изображения животного. Следует добиться положения осветитель- ного прибора, при котором на темном фоне чашки Петри хорошо освещеныконтурыытела планарии.

После нескольких секунд адаптации планария начинает равномерр- но и прямолинейно перемещаться (скользить) по дну чашки Петри.. Оператор направляет животное к месту регистрации видеокамерой, медленно поворачивая чашку Петри с планарией. После тогоо, как жии- вотное появляется в поле зрения микроскопа, начинается ее видеорее- гистрация при нажатии компьютерной мышкой кнопки «Старт» на интерфейсе видеограббера.

В результате получается небольшой видеофильм (8 −— 20 кадров), записаннанный в оперативной памяти видеограббера DigitEyeП1еиЕуе--15.. После этого оператор выбирает оптимальный кадр и сохраняет его на жестт- ком диске компьютера нажатием кнопки «Сохранить кадр» на интер- фейсе видеограббера. При необходимости запись повторяется до по- лучения изображения требуемого качества.

9. Провести анализ изображения контрольных и интактных планаа- рий с помощью компьютерной программы..Дляля этого работу начатьс открытия файла с изображением планарии. Это происходит путем нажатия кнопки «Файл»». При этом изображение планарии выводится на экран интерфейса. Затем начинается обработка изображения. Внаа- чале нажимается кнопка «Автоматическогичо анализа изображения»». Затем стрелка компьютерной «мышки» помещается на край изобра- жения планарии и нажимается левая кнопка мыши.. Часто при автомаа- тическом оконтуривании объекта программа обрисовывает его с ви- димыми ошибками. Оператор исправляет ошибки программынажатии- ем кнопки и отсекает ненужные части в «ручном» режиме. Следую- щая кнопка предназначена для отделения старых и новыхчастей тела

23

11. Полученные результаты проанализировать с помощью стати- стических програмамм для выявления токсического эффекта от воздей- ствия хлорида кадмия. 20-процентное отклоненияот контроля указы- вает на высокую токсичность..

Приложение22. Морфогенезорфогенез и биология планарий Следует отметить особое место морфогенезна в биологии планарий.

Впервую очередь, это касается способности планарийк регенерации.

Это свойство имеет очевидный приспособительныльный характер, по-

скольку у планарий нет внешнего или внутреннего скелета. Тело

практически не защищено от механических травм,, и способспособностьность к

регенерации обеспечивает лучшие условия к выживаниюю.. Однако по-

мимо регенерации у планарий имеется еще минимум две системы жизнеобеспечения, непосредственно связанные с морфогенезом:: бес-

полое размножение и пищеварение.

Планарии −— гермафродитные животные. Большинство видов имеют

мужские и женские гонады.. Каждую весну они спариваются и откла--

дывают коконы—– небольшие (ддиаметром около 0,5 мм) круглые обра- зования, из которых после завершения эмбрионального развития вы- плаживаются маленькие особи. Многиеног планарии обладают также способностьью к бесполому размножению -—– поперечному деленинию на две частии:: головнувную –-— материнскукую и дочернюрнюю –- хвостовую. Далее

головная особь отращивает себе новый хвост, а из небольшого хво- стового фрагмента путем сложной перестройки формируется новое животное, обычно около 1 −— 2 мм длиной, которое начинает самостояя- тельно питаться и растии. Мехаехнизм формирования нового хвоста у материнской особи и образование нового животного из хвостового фрагмента являются морфогенезом (или регенерацией), протекающающим в естественных условиях. Кроме того необходимо отметить особую «морфогенетическукую» особенность пищеварения планарий. После всасывания планарией пищи через мускулистуую глотку происходит распад ее пищеварительной трубки на отдельныеклетки, и все содер-

жимое этой трубки становится доступным для остальных клеток тела планарии.. Они захватызахватываютвают частицы пищи и переваривают ее.. Этот

25

процесс называется фагоцитозом и является типичным случаем при- митивной организации пищеварения у простых организмов. После завершения переваривания частиц пищи происходит процесс обрат- ной сборки пищеварительной трубки и восстанавливается внутренняя структура организма планарий. Таким образом, пищеварение у планаа- рий сопровождается и обеспечивается путем распада-сборки пищеваа- рительноййтрубки,,т.те.е. фактически морфогенетическими механизмами.

Приложение33. Лабораторные планарии (бесполая расаа)

Для экспериментальных целей пригодны планарии лабораторной бесполой расы ВизеяаDugesia tigrinaпзппа.. Они размножаются бесполым путем —– отделением хвостового фрагментамента. Эту особенность размножения планарий необходимо учитывать в эксперименте. Спонтанное раз- множение (делениее) планарий является наиболее распространеннытраненным артефактом при работе с планариями бесполой расы. Такое размножее-

ние животных в ходе опытов спспособно нарушить ход экспериментов..

Такие случаи (три –- четыре особи на эксперимент из 30-ти регенеран- тов) бывают практически в ходе любого эксперимента с регистрацией регенерации более трех дней. Этот фактор, несомненнонно, отрицательно влияет на чистоту эксперимента, поэтому данные особи исключаются

из опытов.. Необходимо учитывать еще один факт.. Планарии чаще де-

лятся при одиночном содержании,,аа в группе процент разделившихся

особей гораздо меньше. В специальных опытах была показана важная пусковая роль нервного ганглия для процесса деления. Оказалось, что после перерезки планарий деление у них заторможено, а после обра-

зования нового ганглия животные вновь начинают делиться.. Для тортор-- можения деления планарий во время опытов по регенерации применяя--

ется следующая схема:: тридцать планарий одной экспериментальной группывместе помещаются в один сосуд с 20 −-— 30 мл воды((в зависи- мости от характера опыта) сразу после операции. При этом бесполое размножение планарий заторможено и данный артефакт не мешает работе. Другой способ избежать влияния спонтанного деления планаа- рий −- регистрировать результат морфогенеза на относительно ранней

26

стадиии, на третий день после перерезки. Это также снижает вероят- ность спонтанного деления регенерантов.

Отрастание хвостовой части тела у материнской особи и формироо-

вание нового животного из хвостового фрагмента включают в себя пролиферацицию и дифференцировкуклеток из недифференцированных

резервных клеток —– необластов. Таким образом, можно использовать деление планарий как вторурую дополнительнуную модель морфогенезн а и

сравнитьее с регенерацией. Это бывает полезно для экспериментов по влиянию разных внешних факторов на процессы морфогенеза.

Для стимуляции бесполого размножения планарий кормят моты- лем или печенью,,а через сутки отбирают животных длиной не менее 10 ммм, готовых к делению, и рассаживают по одному в стаканчики с 50 мл воды. Стаканы помещаютв затененном месте при оптимальной для размножения температуре 25 о°С. Как правило, в течение первых

суток делится порядка 5 −— 10 животных.. Максимум деления наступает

на вторые –- третьи суткии. Эту особенность планарий можно использо- вать для проведения опыта по оценке скорости бесполого размножее-

нияНИЯ ЖИВОТНЫХживотных.

Приложение44. О методе оценки регенерационной активности

Регенерация планарий является одним из классических объектов

биологии развития.. Этому способствовали

> легкость воспроизведения модели −— практически в нестерильь- ных условиях происходит регенерация любойчасти тела планарий;:

> относительная быстрота восстановительного процесса −— реге- нерация головного конца тела планарий с головнывным ганглием прохоо- дит в течение трех –- пяти днейй;

> простота регистрации самого процесса восстановления −— есте- ственнывенным и хорошо различимым критерием завершенности регенера- ции служило появление новых глаз у регенерантанта.

В пособии [4] описаны этапы становления метода оценки регене- рационной активности планарий.. Вначале регистрацитрацию регенерации проводили фотографированием движущихся планарий-регенерантов через окуляр бинокулярного микроскопа. Далее проецировали негати-

27

вы и проводили анализ изображений планарий путем измерения дли- ны бластемемы и всей планарии. Во второй модификации метода для регистрации размеров тела планарий использовали дигитайзер –— спе- циальный электронный планшет, применяемый для переноса различ- ных изображений(карт( , схем, рисунков) в память компьютера. Таким

образом, обводили и регистрировали все размерные параметры тела

планарий (длину, ширину и площадь бластемы))и всей планарииис по-

мощью специального пакета програмрамм на базе компьютера PDPРОР--11..

Основным недостатком метода прижизненной морфометрии была не- возможность коррекции артефактов фотосъемкитосъемкив ходе опыта.

Основным отличием компьютерной морфометрии регенерации планарий от всех предыдущих является прямая прижизненная реги- страция величиныотрастающей части тела регенерантов —– бластемыи разработка относительных количественных критериев –— показателей динамики регенерации планарий..

2.2. Оценка степени антропогенннойнагрузкина гидроо-

сферу по морфометрическим изменениям у рясковых

LemnaТетпа minorттог

Успех биологического тестирования во многих случаях зависит от выбора тест-объекта. Тест-объект −— это организмм, помещенныйв ана- лизируемую среду, по биохимическимм, генетическим, морофоо- физиологическим и другим показателям которого судят о его состоя- ниии. Тест-объектом для данной работы выбрана ряска малая (LemnaГетпа minorттогГ..L),. поскольку в отличие от других видов рясковых(ряска( гор-

батая (LemnaГетпа gibbaащфа L1..), ряска тройчатая (LemnaГетпа trisulcaтэшса LГ..), многокоо-

ренник обыкновенный (5SpirodellaргоаеЦа роутишаpolyrrhiza (LГ..) Schleid))$сШе19)) она непри- хотлива в содержании, имеет достаточнуую для анализа площадь ли- стецов и не имеет сезонного периодизма..

Культуру тест-объекта поддерживают на питательной среде (табл.

4), которуую готовят на дистиллированннойводе [6].

28