Программа ИБП

Окисление - Видим, что у нас трехвалентый фтор, окисляем его до 5 валентного под действием I2 и воды. Это единственная стадия, которая идет в кислых условиях, а так весь синтез идёт в водной среде.

Кэпирование - Кэппинг нужен для того, чтобы исключать что на предыдущих стадиях может что-то не присоединиться.

Отделение олигонуклеотида от твердого носителя происходит в концентрированном растворе аммиака или в ама ( метиламин и аммиак 50:50)

Пост-синтетическая обработка: снятие ацильных защитных групп на азотистых основаниях бензоильной с А, ацетильной с Ц, изобутирильной с Г; 2-цианоэтильных групп с фосфатных групп.

Стадия очистки и выходного контроля: хроматографическая очистка – обращеннофазовая вэжх, ионообменная вэжх, тангенциальная фильтрация; электрофоретическая очистка; выходной контроль - масс-спектрометрия.

2.В чём различия подходов в олигонуклеотидном синтезе для молекулярной биологии и в олигонуклеотидном синтезе для терапевтических приложений.

Для терапевтических приложений используют ДНК-синтезаторы (для автоматизированного синтеза нуклеотидов). Для синтеза олигонуклеотидов в терапевтических целях используют специальное промышленное оборудование.

Вобщем виде автоматический синтезатор представляет собой систему, состоящую из реакционной камеры, емкостей для реагентов, коммуникаций и клапанов для подачи реагентов под давлением инертного газа. При этом в реакционной колонке находится твердофазный носитель с иммобилизованным мономером, а последовательное добавление реагентов позволяет наращивать олигомерную цепочку без выделения и очистки промежуточных продуктов. В качестве твердой фазы используют высокопористое стекло (CPG) или полистирольные шарики. Исходные нуклеотидные мономеры химически присоединяются к поверхности твёрдой фазы с помощью специальных линкеров. Химическая природа линкеров такова, что они разрушаются под действием аммиака или метиламина, что позволяет после окончания синтеза легко отделить олигонуклеотиды от твёрдой фазы. Возможно использование стабильных линкеров, при этом после деблокирования олигонуклеотиды остаются иммобилизованными на твердофазном носителе, что актуально при синтезе на микрочипах. http://www.genterra.ru/synth-process.html

3.Полимеразная цепная реакция. Принцип. Области применения.

Полимеразная цепная реакция – экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты в биологическом образце.

Метод основан на многократном избирательном копировании определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro).

Компоненты реакционной смеси:

ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать.

Два праймера, комплементарные концам требуемого фрагмента.

Термостабильная ДНК-полимераза — фермент, который катализирует реакцию достраивания второй цепи ДНК согласно принципу комплементарности

Дезоксинуклеотидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) - используемый Taqполимеразой для синтеза второй цепи ДНК.

Ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы.

Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условияреакции — рН, ионную силу раствора. Содержит соли, бычий сывороточный альбумин.

ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок.

Стадии амплификации:

Денатурация - Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94—96°C, чтобы расплести двойную спираль. Разрушаютсяя водородные связи между двумя цепями днк.

Отжиг – прйамеры присоединяются к одноцепочечной днк-мишени, Отжиг происходит в соответствии с правилом комплементарности (напротив аденина-тимин, напротив гуанина - цитозин. Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей.

Элонгация - Taq-полимераза начинает достраивание второй цепи ДНК с 3 '-конца

праймера. Детекция результатов:

FLASH – метод детекции с добавлением флуоресцентной метки

В Real-time: в реакционную смесь добавляют ДНК-зонды, в состав которых входят:

•флуоресцентная метка в 5’-положении

•гаситель флуоресценции в 3’-положении

•фосфатная группа в 3’-положении

ДНК-зонд – искусственно синтезированный олигонуклеотид, меченный флуоресцентной меткой, который используется для гибридизации со специфическим участком мишени. Позволяет идентифицировать комплементарные ему последовательности. Эти зонды имеют места посадки внутри амплифицируемой области.

Этот зонд находится в месте посадки внутри амплифицирующейся цепи. Полимераза при ПЦП разрушает зонд, и мы наблюдаем это в режиме реального времени.

Области применения ПЦР: медицина; ветеринария и растениеводство; наука; промышленность; судебная медицина.

4. Эпигенетика. Объект исследования.

Эпигенетика – наука изучающая закономерности эпигенетического наследования — изменения экспрессии генов или фенотипа клетки, вызванных механизмами, не затрагивающими последовательности ДНК. Эпигенетические изменения сохраняются в ряде митотических делений соматических клеток, а также могут передаваться следующим поколениям. Примерами эпигенетических изменений являются метилирование ДНК и деацетилирование гистонов.

Предметом эпигенетики является изучение наследования активности генов, не связанной с изменением первичной структуры входящей в их состав ДНК. Эпигенетические изменения направлены на адаптацию организма к изменяющимся условиям его существования.

5. Высопроизводительное секвенирование. Геном или экзом.

Как устроено высокопроизводительное секвенирование (NGS):

Выделение геномной ДНК

Приготовление библиотек

Обогащение

Секвенирование

Анализ данных

Секвенирование нового поколения — техника определения нуклеотидной последовательности ДНК и РНК для получения формального описания её первичной структуры. Технология методов секвенирования нового поколения (СНП) позволяет «прочитать» единовременно сразу несколько участков генома, что является главным отличием от более ранних методов секвенирования. СНП осуществляется с помощью повторяющихся циклов удлинения цепи, индуцированного полимеразой, или многократного лигирования олигонуклеотидов. В ходе СНП могут генерироваться до сотен мегабаз и гигабаз нуклеотидных последовательностей за один рабочий цикл.

Геном — совокупность всей генетической информации организма, его полный хромосомный набор и внехромосомные элементы.

Экзом. 1% - это последовательность всех кодирующих элементов генома.

6. Методики CRISPR-Cas. Перспективы использования.

CRISPR – это иммунная система бактерий и архей, спасающая микроорганизмы от вирусов. Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeats («короткие палиндромные повторы,

регулярно расположенные группами»)

CRISPR — короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами — особые локусы бактерий и архей, состоящие из прямых повторяющихся последовательностей, которые разделены уникальными последовательностями (спейсерами).

Спейсеры заимствуются из чужеродных генетических элементов, с которыми сталкивалась клетка (бактериофагов, плазмид). РНК, транскрибирующиеся с локусов CRISPR, совместно с ассоциированными белками Cas обеспечивают адаптивный иммунитет за счёт комплементарного связывания РНК с нуклеиновыми кислотами чужеродных элементов и последующего разрушения их белками Cas. Впрочем, к настоящему моменту имеется немало свидетельств участия CRISPR в процессах, не связанных с иммунитетом.

Использование методик CRISPR-Cas для направленного редактирования геномов является перспективным направлением в современной генной инженерии. На 2016 год учёные широко используют подходы, основанные на системах CRISPR-Cas; возможно, в будущем эти подходы будут применять в медицине для лечения наследственных заболеваний.

Юрий

Лекция 1.

1. Метаболизм клеток млекопитающих (гликолиз, цикл Кребса и т.д.)

Главные пути:

1) Гликолиз – процесс окисления глюкозы, при котором из одной молекулы глюкозы образуется две молекулы пировиноградной кислоты.

Сопровождается запасанием энергии в форме АТФ и НАДН.

Универсальный путь катаболизма глюкозы и один из трех путей окисления глюкозы, встречающихся в живых клетках.

Глюкоза+2НАД++2АДФ+2Pi = 2пируват+2НАДН+2Н++2АТФ+2H2O

2)Пентозофосфатный - альтернативный путь окисления глюкозы.

Распространен у растений и животных и вспомогателен у микроорганизмов.

Служит для образования восстановленной НАДФН, который используется как донор

водорода.

3-глюкозо-6-фосфат+6НАДФ+ = 3CO2+6(НАДФН+H+)+2фруктозо-6-фосфат+L- глицеральдегид-3-фозфат = пируват+2АТФ

3) Цикл Кребса (цикл трикарбоновых кислот) – центральная часть общего пути метаболизма, циклический биохимический процесс, в ходе которого ацетильные остатки (CH3CO-) окисляются до CO2. За 1 цикл образуется 2 молекулы СО2, 3 НАДН2,и 1 ГТФ(или АТФ). Электроны находящиеся на НАДН и ФАДН2 в дальнейшем переносятся на дахательную цепь, где в ходе реакций оксиления фосфолир. образование АТФ. Это важный источник молекул предшетвенников.

4)Окислительное фосфорилирование

Метаболический путь, при котором энергия образовавшаяся при окислении пит. веществ запасается в митохондриях клеток в виде АТФ.

Происходит переход электронов от соединений доноров к соединениям акцепторам в ходе ОВР

У эукариот осуществляется несколько белковыми комплексами во внутр. митохондр. мембране, а у прокариот в межмембранном пространстве клеток

Набор электронов составляет электронно транспортную сеть

5)Глутаминолиз. Путь утилизации глутамина важен для метаболизма и биосинтеза раковых клеток. Комплекс биохимических реакций , при которых АК глутамин расщепляется до длутамата, аспартата, СО2, пирувата, лактата, аланина и цитрата.

6)Метаболизм АК.

2.Кратко объясните различия между клетками млекопитающих, растительными и бактериями с точки зрения культивирования

3. Основные компоненты питательной среды клеток млекопитающих

Сверхчистая вода

Глюкоза и АК (глутамин, аргинин, гистидин)

Витамины

Микроэлементы

Буферный раствор (NaHCO3, HEPES, MOPS)

Сыворотка (минимизирует shear stress) и заменители сыворотки (инсулин, альбумн)

Защищающие вещества (ПЭГ, Pluronic F68)

Критические концентрации: 4 ммоль/л аммиак, 40 ммоль/л лактат

4. Плюсы и минусы сывороточной и бессывороточной сред

5. Методы стерилизации сред

Компоненты среды для клеток млекопитающих содержат соединения, которые разлагаются при нагревании (автоклав не подходит), многие чувствительны к свету (стеклянные реакторы закрывают фольгой)

Варианты:

1)Стерильная фильтрация (поры 0,1-0,2 мкм). Освобождение жидкостей от М/О путем их задержки на специальных фильтрах. Основное действие заключается не в механической задержке, а в адсорбции М/О на большой поверхности, образуемой стенками пор фильтра.

2)HFST – стерилизация (high temperature short time, 140-160 С от милисекунд до 180с)

6. Основные современные биотехнологические продукты

Продукты, получаемые из клеток:

Гликопротеины (антитела, терапевтические белки)

Вирусы (генная терапия, вакцины)

Вторичные метаболиты (для производства лекарств и косметики) Клетки как продукты:

Суспензионные клетки для клеточной терапии (клетки костного мозга)

Функциональные ткани для трансплантации (хондроциты)

Экстракорпоральные органоиды (искусст. печень и почки)

7. Гидродинамический стресс

Источники:

Столкновение клеток с твердыми поверхностями (пузырьки, мешалки)

Поднимающиеся и разрывающиеся пузырьки

Дренажный эффект пены

Тип клеток, геометрия реактора, тип перемешивания среды Индикаторы:

Изменение морфологии

Образование кластеров

Уменьшение скорости роста и выживаемости

Снижение продуктивности

Лекция 2.

1. Перечислить основные показатели, которые контролируют в процессе культивирования

Параметры:

1) Физические

CL-вжидкости

C* - в воздухе

Эффекты зависящие от ДО:

-подержание культуры в хорошем состоянии

-выработка лактата повышается при снижении ДО

-зависимость качества продукта от ДО Недостаточно – нет дыхания, плохое усвоение Превышено – окисление клеток, мутации клеток

Существуют амперометрические и оптические датчики. В любом случае существует возможность искажения данных налеплением пузырей.

5.Объяснить, зачем нужна процедура субкультивирования, как она происходит

Субкультура (первичная культура) является источником работающих культур. Хранятся в

жидком азоте. Являются «запасом прочности», откуда в любое время можно получить «свежие клетки» Млекопитающие:

1)с помощью ферментов выделяют из ткани

2)отделяют от ферментов и суспендруют

3)Инокулируют в специальном стеклянном или пластиковом сосуде с плоским дном Важно сохранить чистоту!

6. Фазы клеточного роста

7. Клеточные банки. Хранение, заморозка, разморозка клеток

Банки клеток: криопробирки и криомешки Криоконсервирование в жидком азоте. Клеточная суспензия замораживается мдленно и

бережно. Используются защищающие агенты. Долгосрочное хранение в азоте. Размораживают быстро и сразу помещают в полную ростовую среду.