4219

11

Рис. 4. Климаткамера для выращивания пробирочных культур древесных пород

Для пересадки (эксплантирования) регенерантов используют пинцеты, скальпели и другие инструменты (рис. 5).

Рис. 5. Пересадка регенерантов в ламинар-боксе

Для приготовления питательных сред необходимы технические и аналитические (или торсионные) весы для взвешивания составных частей для

12

питательных сред, рН-метр для установления определенного рН питательной среды.

Заключение

Таким образом, для эффективного культивирования регенерантов древесных растений in vitro требуется необходимый комплект инструментов

иоборудования:

-Ламинарные боксы с бактерицидным облучением для проведения работ с асептическими культурами;

-Дистиллятор для получения дистиллированной воды и приготовления питательных сред;

-Автоклав и сушильный шкаф для стерилизации питательных сред, инструментов, культуральных сосудов, чашек Петри и др.

-Технические и аналитические (или торсионные) весы для взвешивания составных частей для питательных сред;

-рН-метр для установления определенного рН питательной среды;

-Климатическая камера или комната для выращивания культур в контролируемом режиме, термостат;

-Инструменты (анатомические пинцеты, скальпели, шпатели, ножницы, секатор, лезвия) для манипуляций по эксплантированию, пересадке и микрочеренкованию материала в ламинарных боксах;

-Колбы и стаканы из термостойкого стекла на 0,25; 0,5; 0,8 и 1 л; мерные цилиндры на 25, 50мл, 1 и 2 л, мерные пипетки на 1, 2, 5 и 10 мл для приготовления питательных сред, стерилизации воды и растительного материала. Склянки с притертыми пробками для хранения маточных растворов (50, 100 мл, 1 л).

-Стеклянные или пластиковые сосуды (биологические пробирки, банки, контейнеры и колбы емкостью до 250 мл) для выращивания культур, чашки Петри;

-Алюминиевая фольга для колпачков на культуральные сосуды; вата для работы в боксе; этиловый спирт для спиртовки и других стерилизационных работ в боксе; электроплитка.

Для промышленного производства посадочного материала древесных растений и создания лесных плантаций необходимо создание биотехнологического комплекса или последний рекомендуется включить отделом в селекционно-семеноводческие комплексы, которые создаются во всех регионах России.

2. Методы стерилизации при проведении работ с культурой тканей березы, ольхи и тополя

Одним из необходимых условий успешной работы с культурой тканей является соблюдение условий асептики. Питательная среда, используемая для культивирования растительной ткани, является благоприятным

13

субстратом для развития микроорганизмов, содержащихся как на поверхности экспланта, так и на лабораторной посуде, инструментах, рабочих поверхностях, руках и одежде исследователя. Микроорганизмы, развиваясь на питательной среде, выделяют продукты своего метаболизма, изменяют ее состав; кроме того, они могут развиваться и на самом эспланте, приводя его к гибели. Поэтому перед введением в культуру проводят поверхностную стерилизацию растительного материала, все манипуляции с культурой изолированных тканей осуществляют в ламинар-боксе, используя стерильные питательные среды, стерильную посуду и инструменты, соблюдая при этом правила асептики.

2.1. Стерилизация посуды, ламинар-бокса и питательных сред

Посуду моют, используя бытовые моющие средства, промывают водопроводной водой, ополаскивают дистиллированной водой, высушивают, заворачивают в плотную бумагу или помещают в бюксы. После этого её стерилизуют сухим жаром в сушильном шкафу при 160 °С и в течение не менее двух часов или влажным паром в автоклаве 1 час при давлении 1 атм

(121 °С).

Стерилизация ламинар-бокса. В ламинар-боксе размещают спиртовку, спички, емкость с 96 % спиртом, стерильную посуду и инструменты, необходимые для работы. Перед работой ламинар-бокс облучают бактерицидной лампой в течение 20 – 30 мин, затем осуществляют продувку в течение не менее 30 мин, после чего поверхности обрабатывают спиртом и приступают к работе. Перед работой руки моют с мылом и протирают спиртом; работают в чистых халатах.

Стерилизация питательных сред. Питательные среды стерилизуют в автоклаве при давлении 1 атм в течение 20 мин. Если в состав питательных сред входят вещества, не выдерживающие высокой температуры, их стерилизуют, пропуская через бактериальные фильтры с диаметром пор 0,2 – 0,45 мкм и добавляют в автоклавированную, остывшую до 40 °С питательную среду.

2.2. Поверхностная стерилизация растительного материала (эксплантов)

Поверхностная стерилизация растительного материала проводится с целью освобождения растительных тканей от микроорганизмов. Получение первичных культур является сложной задачей, поскольку поверхность всех органов растений заселена сапрофитными грибными и бактериальными организмами или их спорами, которые in vitro получают возможность для бурного роста и развития и подавляют рост растительной ткани. Поэтому перед посадкой эксплантов на питательную среду их необходимо освободить от внешних сапрофитов, то есть провести поверхностную стерилизацию. Внутренние ткани растений считаются стерильными, однако в ряде случаев в

14

них могут находиться сапрофитные микроорганизмы, которые не всегда обнаруживаются визуально. Основным условием успешного введения исходного материала в культуру является правильно подобранная и проведенная поверхностная стерилизация.

Поверхностная стерилизация растительной ткани проводится в несколько этапов:

-механическая очистка растительной ткани от почвы и растительных остатков;

-промывка бытовыми моющими средствами;

-ополаскивание дистиллированной водой;

-обработка дезинфицирующим веществом;

-промывка стерильной дистиллированной водой;

-обработка в растворе антибиотика.

В качестве дезинфицирующих веществ используют различные химические вещества, при этом их концентрации и длительность воздействия подбираются индивидуально в зависимости от особенностей растительного объекта (табл. 1).

Длительность воздействия дезинфицирующего раствора (экспозиция) зависит от свойств используемого вещества и от особенностей растительной ткани.

С целью удаления внутренней инфекции, содержащейся, как правило, в сосудах растений, растительную ткань дополнительно обрабатывают

15

растворами антибиотиков: ампициллина (0,5-1,0 г/л), бензилпенициллина

(830 мг/л), тетрациклина (200-400 мг/л).

2.3. Регламент стерилизации эксплантов сортов тополя

Для отдельных видов, форм, сортов древесных пород стерилизация эксплантов имеет свои особенности.

Первый этап клонального микроразмножения растений – отбор ценных генотипов, изолирование эксплантов и получение хорошо растущей стерильной культуры.

Одной из трудностей работы с взрослыми экземплярами лесных древесных растений является сильная зараженность тканей и органов грибами и бактериями, что значительно затрудняет обеспечение асептики культуральных эксплантов. Поэтому важным является отработка условий получения асептических культур, которые одновременно обладали бы высокой жизнеспособностью и морфогенетической активностью.

Рекомендуется испытывать в различных сочетаниях следующие стерилизующие агенты: хлорсодержащие (гипохлорит кальция, “Domestos” и “Белизна”), спирт, перекись водорода, мертиолят – ртутьсодержащее вещество. Всего 5 вариантов стерилизации.

1.96 % спирт (2 с) → гипохлорит кальция (40 г/л, 30 мин) → 5-кратная промывка стерильной дистиллированной водой.

2.гипохлорит кальция (40 г/л, 30 мин) → 96 % спирт: 5 % перекись водорода (1:1) 7 мин → 5-кратная промывка стерильной дистиллированной водой.

3.гипохлорит кальция (40 г/л, 10 мин) → промывка в проточной водопроводной воде в течение 10 мин → 0.025 % раствор мертиолята в сочетании с жидким отбеливающим и дезинфицирующим раствором “Белизна” (7 % раствор), 15 мин → 5-кратная промывка стерильной дистиллированной водой. Последние два этапа проводятся в асептических условиях (в условиях ламинар-бокса).

4.“ Domestos” (20 мл/л, 15 мин) → промывка в проточной водопроводной воде в течение 10 мин → 0.025 % раствор мертиолята в сочетании с жидким отбеливающим и дезинфицирующим р-ром “Белизна” (7 % р-р), 15 мин → 5-кратная промывка стерильной дистиллированной водой. Последние два этапа проводятся в асептических условиях (в условиях ламинар-бокса).

5.0.025 % раствор мертиолята в сочетании с жидким отбеливающим и дезинфицирующим раствором “Белизна” (7 % раствор), 15 мин → 5-кратная промывка стерильной дистиллированной водой. Вся работа проводится в асептических условиях (в условиях ламинар-бокса).

Результаты исследований с сортами тополя сереющего 2011 г. представлены в табл. 2.

16

Таблица 2 Эффективность стерилизации первичных эксплантов тополя сереющего в зависимости от сроков изоляции и способа стерилизации эксплантов, генотипических особенностей исходных деревьев. Питательная среда - WPM с добавлением 6-БАП (6-бензиламинопурина) – 0.5 мг/л

Примечание: учет проводился через месяц от начала культивирования. Расшифровка способов стерилизации приведена в тексте. В таблице представлены средние значения из трех экспериментов (повторностей). В каждой повторности использовалось не менее 10-15 культур на вариант. * - различия с вариантами, помеченными звездочкой достоверны при Р < 0,01.

Стерилизация сегментов тополя погружением в 96 % спирт на 2 с с последующей обработкой гипохлоритом кальция (40 г/л, 30 мин, 1 варинт), так же как и использование 5 % раствора перекиси водорода в сочетании с раствором 96 % спирта (1:1, 2 вариант) оказалась недостаточным для уничтожения инфекции у всех изучаемых образцов в равной мере. Жизнеспособные в культуры в этих вариантах получены не были.

Более успешными оказались варианты 3, 4 и 5 с использованием 0,025 % раствора мертиолята. Эффективность стерилизации в этом случае составила от 12,5 до 89,5 % (табл. 2). Причем, оптимальным вариантом стерилизации побегов была предобработка побегов раствором “Domestos” (20 мл/л в течение 50 минут), а затем основная стерилизация мертиолятом (0,025 % в течение 15 минут) – вариант 4.

Так, при таком способе стерилизации в июне у тополя Хоперский 1 получено 89,5 ± 3.7 % асептических и жизнеспособных культур, а у тополя Приярского - 75,0 ± 4.8 %, что достоверно выше (при Р<0.01) по сравнению с другими вариантами (рис. 6). При предобработке в том же месяце побегов гипохлоритом кальция (2 вариант) или без их предобработки (5 вариант) было получено от 25,0 до 50 %.

Из табл. 2 видно, что лучшим сроком заготовки побегов тополя с маточного взрослого дерева и изоляции эксплантов для культивирования в условиях in vitro является июнь. В этом случае получено наибольшее количество стерильных и жизнеспособных культур – от 40 до 89,5 % у тополя Хоперский 1 и от 25 до 75 % – у тополя Приярского. Экспланты же зимних (особенно длительно хранившихся черенков) характеризовались

17

достаточно высокой инфицированностью. Количество стерильных и жизнеспособных культур в последнем случае составила соответственно от

13,3 до 30,7 % и 12,5 – 27,5 % (табл. 2).

а

б

Рис. 6. Общий вид асептических жизнеспособных первичных культур тополя сереющего (слева – т. Хоперский 1, справа – т. Приярский) при

оптимальном режиме стерилизации (вариант 4):

а – одноузловые сегменты неодревесневших летних побегов, изолированные в июне;

б – начало развития пазушных почек. Питательная среда WPM, дополненная БАП 0,5 мг/л и ГК 0,2 мг/л

Из табл. 2 также видно, что выход асептических жизнеспособных культур зависел от генотипа материнского дерева. В пределах одного (оптимального) срока изоляции эксплантов наибольшее количество асептических и жизнеспособных культур в среднем получено у тополя Хоперский 1 (35,9±5.1 % с варьированием в зависимости от режима стерилизации от 0 до 89,5±3.7 %), что достоверно выше (при Р < 0,01), чем у тополя Приярского (26,1±4.1 %, с варьированием от 0 до 75 %).

Таким образом, выявлены значительные различия в эффективности стерилизации побегов в зависимости от сроков изоляции и способа

18

стерилизации эксплантов, генотипических особенностей исходных деревьев. Определены сроки изоляции эксплантов и оптимальные режимы их стерилизации, которые обеспечивают получение до 89,5±3.7 % асептических жизнеспособных культур у тополя Хоперский 1 и до 75,0±4.8 % у тополя Приярского. Показано, что лучшие результаты дает поэтапная стерилизация побегов: предобработка побегов 2 % раствором “Domestos” в течение 15 минут, а затем основная стерилизация 0.025 % раствором мертиолята в сочетании с жидким отбеливающим и дезинфицирующим раствором “Белизна” (7 % раствор) в течение 15 мин.

Идентичные результаты получены при исследовании стерилизации эксплантов ольхи и березы. То есть, на качество стерилизации побегов оказывает большое влияние использование мертиолята.

2.4. Питательные среды для микроклонального размножения

Успех репродукции селекционно ценных форм древесных растений путем микроклонального размножения in vitro во многом зависит от поверхностной стерилизации эксплантов.

Нами выявлено, что использование летних черенков (эксплантов) для культуры in vitro почти в 2 – 3 раза повышает укореняемость растений.

Выявлены значительные различия в эффективности стерилизации эксплантов.

Определены сроки изоляции эксплантов и оптимальные режимы их стерилизации, которые обеспечивают получение до 90 % асептических жизнеспособных культур у тополя сереющего и до 75,0 % у березы и ольхи.

Отмечено, что лучшие результаты дает поэтапная стерилизация побегов: предобработка побегов 2 % раствором “Domestos” в течение 15 минут, а затем основная стерилизация 0.025 % раствором мертиолята в сочетании с жидким отбеливающим и дезинфицирующим раствором “Белизна” (7 % раствор) в течение 15 мин.

Показано, что результаты регламента стерилизации березы повислой, березы карельской, ольхи черной, ольхи серой и сорта ольхи Воронежской и успех регенерации идентичны с сортом тополя сереющего Приярского.

19

Таблица 3 Состав питательных сред, рекомендуемый для клонального

микроразмножения тополя, ольхи, березы

20

3.Методика видовой идентификации ДНК с помощью молекулярно-генетических методов анализа

3.1.Сбор образцов для ДНК-анализа

Отбор образцов для генетического анализа осуществляют в количестве 20-50 изучаемых растений. Отобранные растения высушивают, этикетируют и отсылают в бумажных пакетах в ДНК-лабораторию для последующего анализа.

Для молекулярно-генетического анализа могут быть использованы любые части растения: хвоя, листья, стебель, корни. Однако лучше выделять ДНК из листьев.

Помимо растительных тканей возможно выделение ДНК из почвы, воды и насекомых.

3.2. Протокол выделения ДНК

Небольшой фрагмент ткани поместить в ступку для растирания, добавить 1 мл прогретого ЦТАБ-буфера (3 % бромид цетилтриметилламоний (ЦТАБ), 1.4М NaCl, 20 мМ ЭДТА, 100 мМ Трис, вода деионизованная) и максимально гомогенизировать образец.

Переместить гомогенат в заранее прогретые в термостате до 65 °С центрифужные пробирки типа эппендорф. Инкубировать 5-7 мин. Навести и внести в каждую пробу равный объём смеси хлороформ: изоамиловый спирт (24:1, соответственно) (работа под вытяжкой). Тщательно перемешать пробы в течение 1-2 минут. Центрифугировать пробы 2-3 минуты при 13 000 g. Перенести супернатант в микроцентрифужные пробирки типа эппендорф. Среднюю и нижнюю фазы в дальнейшей работе не используют. Внести в каждую пробу 0,7 объёма охлажденного в морозилке изопропилового спирта (работа под вытяжкой). Тщательно перемешать пробы в течение 1-2 минут. Центрифугировать пробы 2-3 минуты на максимальных оборотах. Слить жидкость и оставить пробы обсохнуть на воздухе. Добавить в пробирки с пробами этиловый спирт 96 %. Тщательно перемешать в течение 2-3 минут. Удалить жидкость из проб. Повторить процедуру промывки этанолом. Высушить осадок. Добавить в пробы минимально необходимое для растворения осадка количество мQ-воды. Растворить до полного исчезновения осадка. Выделенные ДНК необходимо хранить при – 20 °С.

3.3. Спектрофотометрическое измерение концентрации ДНК

Поскольку концентрация и чистота препарата ДНК являются важными факторами, влияющими на ход дальнейшего анализа, необходимо установление значений этих показателей с помощью спектрофотометра. Для определения количества ДНК измеряют поглощение раствора в областях с длинами волн 260 и 280 нм. Измерение при 260 нм позволяет рассчитать