3756

Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего образования «Воронежский государственный лесотехнический

университет им. Г.Ф. Морозова»

БИОТЕХНОЛОГИЯ

Методические указания к самостоятельному изучению дисциплины для магистров по направлению подготовки 35.04.09 Ландшафтная архитектура

Воронеж 2015

1

УДК630*165.6: 631.147(075.8)

Биотехнология. Методические указания к самостоятельному изучению дисциплины для магистров по направлению подготовки 35.04.09 Ландшафтная архитектура / А. И. Сиволапов; Мин-во обр. и науки РФ, ФГБОУ ВО «Воронеж. гос. лесотехн. университет им. Г.Ф. Морозова». Воронеж, 2015. – 14 с. [Электронный ресурс]

Печатается по решению редакционно-издательского совета ВГЛТУ им. Г.Ф. Морозова.

Рецензент канд. биол. наук, зав лабораторией лесной биотехнологии ВНИИЛГИСбиотех О.С. Машкина

2

ВВЕДЕНИЕ

Биотехнология – наука о методах и технологиях создания и использования генетически трансформированных биологических объектов (растений, животных и микроорганизмов) для интенсификации производства или создания новых продуктов различного назначения.

Учебная практика по биотехнологии для магистров по специальности Ландшафтная архитектура предусматривает знакомство и приобретение практических навыков по трем разделам дисциплины:

-микроклональное размножение растений с использованием биотехнологии in vitro;

-применение метода ДНК-анализа для генетической паспортизации сортов растений;

-биотехнология in vitro в лесокультурной практике.

Поэтапные вопросы биотехнологии in vitro рассматриваются на базе лаборатории биотехнологии ВНИИЛГИСбиотех.

Применение ДНК-анализа рассматривают на базе отдела генетики Воронежского филиала Центра защиты леса.

Практическое внедрение биотехнологии in vitro в лесокультурной практике рассматривается на базе Учебно-опытного лесхоза ВГЛТУ.

Биотехнологический процесс включает следующие компоненты: биологический агент, субстрат, целевой продукт, аппаратуру и совокупность управляющих ими методов. Регенерация – восстановление целого организма из его части. Наиболее сложной является регенерация растений из отдельных клеток. Особенно трудно этот процесс происходит у древесных растений.

1 ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ДИСЦИПЛИНЫ

1.1 Целью изучения биотехнологии является овладение магистрами теоретических основ клеточной и генетической инженерии, практическими навыками клонального микроразмножения растений, в том числе ценных древесно-кустарниковых декоративных пород.

1.2 Для достижения поставленной цели решаются следующие задачи:

ознакомить магистров с основами клеточной и генетической инженерии и с основами современного грибоводства;

освоить приемы, способы и методы вегетативного размножения растений in vitro;

ознакомить с основными биотехнологическими приемами, используемыми в селекции;

освоить способы культивирования грибов-лигнотрофов;

ознакомиться с правовыми основами в биотехнологии.

3

1.3 Дисциплина «Биотехнология» относится к блоку дисциплин по выбору М2.В.ДВ.1.1

2.ТРЕБОВАНИЯ К УРОВНЮ ОСВОЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ДИСЦИЛИНЫ

В результате обучения магистр должен:

Знать основы клеточной и генетической инженерии и современного грибоводства; основные методы биотехнологии; этапы и методы клонального микроразмножения растений; приемы культивирования грибов-лигнотрофов.

Уметь разбираться в особенностях различных биотехнологических

приемов, использовать их в лесохозяйственной практике и ландшафтном строительстве.

3. СОДЕРЖАНИЕ РАЗДЕЛОВ ДИСЦИПЛИНЫ

Раздел 1. ВВЕДЕНИЕ 1.1 Биотехнология как наука; основные этапы развития метода

культуры изолированных тканей и органов.

Предмет изучения биотехнологии; цели, задачи, методы; основные термины и понятия. Правовые основы биотехнологии.

История становления и развития метода культуры изолированных тканей

Раздел 2. КЛЕТОЧНАЯ И ТКАНЕВАЯ ИНЖЕНЕРИЯ РАСТЕНИЙ

2.1 Культивирование изолированных растительных клеток, тканей и органов; гормональная регуляция процесса.

Особенности метода культивирования растительных тканей in vitro и

изолированных тканей.

Фитогормоны: классификация, функции, механизм действия, взаимодействие в растении; роль в регуляции экспрессии генов, активности ферментов. Использование фитогормонов и синтетических регуляторов роста при культивировании растительных тканей: индукция каллусогенеза и органогенеза.

4

2.2 Типы культур клеток и тканей

Культура каллусных тканей. Дедифференцировка растительных тканей

дедифференцировки и каллусообразования in vitro. Культура клеточных суспензий и одиночных клеток.

Гормононезависимые растительные ткани. Культура меристематичских тканей.

2.3 Индуцированный морфогенез в культуре каллусных тканей

Факторы, определяющие ндуцированный морфогенез в культуре каллусных тканей.

Типы вторичной дифференцировки каллусной ткани: цитогенез, гистогенез, морфогенез, органогенез, соматический эмбриогенез. Схема вторичной дифференцировки в каллусных тканях, факторы, влияющие на дифференцировку. Гормональная регуляция дедифференциации и вторичной дифференцировки растительных тканей.

2.4 КУЛЬТУРА КЛЕТОЧНЫХ СУСПЕНЗИЙ И ЕЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ВЕЩЕСТВ ВТОРИЧНОГО МЕТАБОЛИЗМА

Биотрансформация – основа биотехнологического процесса. Получение биологически активных соединений с использованием методов клеточной и тканевой инженерии. Преимущества этих методов в сравнении с традиционным использованием растительного сырья. Вещества, получаемые с помощью клеточных технологий их использование.

Технологии выращивания клеточных культур для получения веществ вторичного синтеза. Субкультивирование, обновление культуры. Биореакторы применяемые в промышленном производстве веществ вторичного синтеза с помощью клеточных технологий, их классификация.

Раздел 3. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ В СЕЛЕКЦИИ РАСТЕНИЙ

3.1 Клональное микроразмножение растений; возможности его использования в современном лесохозяйственном производстве

Суть метода, его преимущества перед традиционными способами размножения, особенности использования при работе с древесными породами.

Этапы и методы клонального микроразмножения, техника культивирования растительных тканей на разных этапах.

Влияние генетических, физиологических, гормональных и физических факторов на клональное микроразмножение растений. Цикл клонального микроразмножения.

5

Реювенилизация: способы ее проведения; методы и техника. Оздоровление посадочного материала от вирусов и другой инфекции

(культура меристем, методы термо- и хемотерапии).

Практическое использование метода клонального микроразмнжения, перспективы его применения в современном лесохозяйственном производстве.

3.2 Биотехнологические приемы, используемые в селекции как вспомогательные методы получение гаплоидов in vitro и использование их в

семяпочек (гиногенез), гибридного зародыша (партеногенез).

Получение на основе гаплоидов гомозиготных диплоидов и полиплоидов. Теоретическое и практическое значение гаплоидов.

Преодоление последствий отдаленной гибридизации: прогамной и постгамной несовместимости (оплодотворение in vitro и культивирование незрелых гибридных зародышей). Размножение отдаленных гибридов с использованием метода культуры тканей.

3.3 Сохранение генетических ресурсов с использованием методов клеточной инженерии

Понятие генофонда, проблема сохранения существующего генетического разнообразия лесов (генетического потенциала популяций). Традиционные методы сохранения генофонда древесных растений in situ и ex situ.

Использование биотехнологических приемов для сохранения генетического фонда: преимущества и перспективы.

Живые коллекции: растущие (пересадочные) культуры, депонирование in vitro, сохранение растительных тканей в криобанках. Методы и техника криосохранения. Определение жизнеспособности и генетической стабильности растительного материала после длительного хранения: приемы

иметоды.

3.4САМОСТОЯТЕЛЬНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ НОВЫХ ФОРМ И СОРТОВ РАСТЕНИЙ. КЛЕТОЧНАЯ СЕЛЕКЦИЯ РАСТЕНИЙ. СОМАКЛОНАЛЬНАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ РАСТЕНИЙ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO И ЕЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ

Сомаклональная и гаметоклональная вариабельности как источники генетического разнообразия in vitro для создания растений-регенерантов с новыми свойствами. Природа и механизм возникновения сомаклональной изменчивости; факторы, влияющие на ее проявление.

Использование сомаклональных вариантов в селекционной практике; возможность ускорения селекционного процесса.

6

Получение генетически измененных форм растений с помощью мутагенезa in vitro. Особенности культивирования тканей, подвергшихся мутагенному воздействию.

Селекция растений на клеточном уровне, используемый растительный материал. Техника проведения экспериментов по клеточной селекции: подходы и методы. Каллусные культуры как объект клеточной селекции, получение стабильно устойчивых линий каллусных клеток. Протопласты как объект клеточной селекции. Способы получения протопластов. Схема выделения и культивирования протопластов из клеток растений. Теоретическая и практическая значимость протопластов для решения вопросов селекции. Создание неполовых гибридов (соматическая гибридизация) методом слияния изолированных протопластов. Виды соматических гибридов, их характеристика и особенности. Значение соматической гибридизации, возможности ее использования в селекции.

3.5 Клеточная селекция растений. Получение растений-регенерантов, устойчивых к различным факторам

Использование методов клеточной селекции для получения растений-

экстремальным температурам.

Клеточная селекция in vitro как способ отбора растений на устойчивость к патогенным организмам. Схема клеточной селекции растений на устойчивость к грибным болезням.

Раздел 4. СОЗДАНИЕ ИСКУССТВЕННЫХ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ПРОГРАММ С ПОМОЩЬЮ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ. ОСНОВЫ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ.

4.1 Цели, задачи, объекты, основные методы исследований генетической инженерии.

Основные методы создания рекомбинантных ДНК: расщепление ДНК (рестрикция), гибридизация нуклеиновых кислот, клонирование ДНК, определение нуклеотидных последовательностей (секвенирование), химикоферментативный синтез полинуклеотидов.

Основные ферменты генетической инженерии: ДНК-полимеразы, ДНК-лигазы, нуклеазы, рестриктазы. Конструирование рекомбинантных ДНК: соединение фрагментов с одноименными “липкими” концами, соединение фрагментов с разноименными концами, соединение фрагментов по “тупым” концам.

Безопасность экспериментов связанных с генно-инженерными исследованиями.

4.2 Генетическая инженерия растений

Использование методов генетической инженерии в селекции растений.

7

Природные векторные системы на основе Ti и Ri плазмид (плазмиды, фаги). Основные этапы получения трансгенных форм растений. Трансформация растительных клеток: методы кокультивации с агробактерией и прямого переноса генов в растение (биобаллистика). Экспрессия чужеродных генов в геном растений.

Улучшение качества и повышение продуктивности растений методами генетической инженерии. Получение трансгенных растений, устойчивых к патогенам, насекомым, гербицидам, стрессовым факторам.

Значение разработок по генетической инженерии в современном сельскохозяйственном производстве.

Правовые основы в биотехнологии.

Раздел 5. ГРИБОВОДСТВО КАК ОТРАСЛЬ БИОТЕХНОЛОГИИ

5.1Культивирование съедобных грибов: возможности и перспективы

Общая характеристика грибов, их место в системе органического мира. Культивируемые грибы: история вопроса, становление и развитие грибной индустрии, современное состояние грибоводства. Грибной бизнес в России.

Экологическая, пищевая, лекарственная ценность грибов. Разведение грибов в искусственных условиях, возможность утилизации отходов сельскохозяйственного, лесного, бумажного перерабатывающего производств. Цикл культивирования грибов. Интенсивная и экстенсивная технологии.

5.2Промышленное выращивание грибов-лигнотрофов

Технологии культивирования вешенки (Pleurotus spp.) и шиитаке (Lentinus edodes): особенности процесса. Штаммовое разнообразие культивируемых грибов.

Факторы роста и плодоношения при искусственном выращивании грибов.

Принципы выбора субстрата для интенсивного культивирования вешенки и шиитаке; источники получения сырья. Состав органических и минеральных веществ субстрата; использование питательных добавок. Способы подготовки субстрата.

Закономерности плодоношения и способы повышения урожайности.

5.3 Выращивание почвенных сапротрофов (шампиньона, кольцевика), некоторых видов микоризных и экзотических грибов

Пищевая ценность шампиньонов. Компосты для культуры шампиньона, технологии их приготовления, роль физических факторов. Экологические аспекты в шампиньоноводстве.

Технология выращивания гриба; болезни и вредители шампиньонов, мероприятия по защите урожая.

Особенности культивирования кольцевика.

8

Выращивание грибов-микоризообразователей: разведение трюфелей, попытки культивирования белого гриба.

Культивирование экзотических видов грибов: разведение сморчков, культивирование фламуллины бархатистоножковой (опенок зимний), опенка летнего, сморчков.

4 ОСНОВНЫЕ ТЕРМИНЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В БИОТЕХНОЛОГИИ

Адвентивные почки – почки, возникшие из тканей и клеток в растениях, обычно их не образующих.

Апикальное доминирование – явление подавления роста боковых почек побега в присутствии терминальной среды.

Андрогенез – процесс возникновения растения из микроспоры или пыльцевого зерна, либо через гаметический эмбриогенез, либо образованием каллюса.

Анеуплоид – ядро, клетка, организм с числом хромосом, отклоняющимся от Х и от чисел, кратных Х.

Биотехнология – наука о методах и технологиях производства

продуктов с использованием биологических объектов.

Гаплоид – ядро, клетка, организм, характеризующиеся набором

хромосом, представляющим половину полного набора, свойственного виду

(символ n).

Генотип – совокупность генов организма.

Гиногенез – процесс возникновения растения из клеток зародышевого мешка.

Генная инженерия – совокупность методов молекулярной генетики,

направленных на получение рекомбинантных нуклеиновых кислот,

осуществление манипуляций с генами.

Дедифференциация – переход специализированных, неделящихся клеток к пролиферации.

Денатурация биополимеров – изменение структуры молекулы,

вызывающее потерю еѐ естественных свойств.

9

Диференциация – комплекс процессов, приводящих к различиям между дочерними клетками, а между материнскими и дочерними клетками.

Диплоид – ядро, клетка, организм, характеризующийся двойным набором хромосом, представленных числом, характерным для данного вида (символ 2n).

ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) – биологический полимер,

носитель наследственной информации всех живых организмов. В ядре клетки

она представлена в виде хромосом.

Каллус – ткань, возникшая путем неорганизованной пролиферации клеток органов растений.

Кариотип – набор хромосом, характерный для данного вида.

Клон – культура, возникшая из одной клетки.

Клональное микроразмножение – получение in vitro неполовым путем растений, генетически идентичных исходному.

Клеточная селекция – метод выделения мутантных клеток и сомаклональных вариаций с помощью селективных условий.

Культура зародышей – стерильное выращивание на питательной среде незрелых или зрелых изолированных зародышей.

Лиофилизат – продукт лиофилизации (способ мягкой сушки вещества)

Линия – культура, возникшая из штамма путем селекции или клонирования, имеющая маркерные признаки.

Митотип – генотип по митохондриальной ДНК.

Моноплоид – ядро, клетка, организм, характеризующийся основным числом хромосом (символ Х).

Морфогенез in vitro – развитие формы или структур (почек, корней, эмбрионов) при регенерации в культуре тканей.

Мутация – изменение в генетическом материале клеток путем перестройки ДНК ядер и органелл, изменения структуры хромосом или путем полиплоидизации.

Органогенез – процесс возникновения в неорганизованно растущей массе каллюсных клеток зачатков органов (корней и побегов).

10