3623

11

2.6. Протокол выделения и очистки ампликона из агарозного геля

(на примере наборов Eurugen Cleanup Mini)

Вырезать фрагменты проб из агарозного геля. Поместить вырезанные фрагменты геля в микроцентрифужные пробирки. Взвесить фрагменты геля.

К каждой пробе добавить три объёма (в данном случае объём приравнивается к массе фрагмента геля) «Связывающего раствора». Инкубировать пробы при 53 °С до полного растворения геля, перемешивая. Весь объём пробы перенести в собранные колонки. Центрифугировать колонки с пробами при 13 000 g 30 секунд. Слить жидкость из собирательной пробирки и добавить в каждую пробу по 700 мкл «Промывочного раствора». Центрифугировать колонки с пробами при 13 000 g 30 секунд. Удалить жидкость из собирательной части колонки. Центрифугировать колонки при 13 000 g 60 секунд. Колонки переместить в чистые микроцентрифужные пробирки. Нанести дозатором на мембрану колонки 12 мкл «Элюирующего раствора». Центрифугировать колонки с пробами при 13 000 g 30 секунд.

2.7. Протокол постановки секвенирующей ПЦР

Концентрация ДНК-матрицы для расчета количества, используемого на секвенирующую реакцию, определяется спектрофотометрически (см. п. 2.3).

В микроцентрифужную пробирку внести 10 мкл реакционной смеси

(Terminator Ready Reaction Mix, праймер (3 мкМ р-р), ДНК-матрица,

деионизованная вода). Соотношение компонентов подбирается эмпирически. Программа амплификации:

1.Первичная денатурация 95 °С – 1 мин. Затем 25-30 циклов:

1.Денатурация 95 °С – 10 с.

2.Отжиг 50 °С – 10 с.

3.Элонгация 60 °С – 4 мин.

Охлаждение реакционной смеси до 4 °С – 5 мин. Хранение 4 °С – ∞

После секвенирующей ПЦР необходимо провести очистку продукта от непрореагировавших компонентов.

12

2.8. Протокол очистки продуктов секвенирующей ПЦР набором

BigDye® XTerminator Purification Kit

Добавить к пробам по 45 мкл буфера «SAMSolution». Тщательно промешать на вортексе «XTerminatorSolution» и быстро добавить к пробам по 10 мкл. Перемешивать в течение 30 минут. Центрифугировать пробы на 1 000 g 2 минуты. Отобрать не менее 10 мкл супернатанта в пробирки для последующего определения нуклеотидной последовательности.

2.9. Протокол определения структуры ДНК на генетическом анализаторе ABI PRISM 310

Электрофоретический анализ и детекцию провести на секвенаторе ABI PRISM 310 в соответствии с прилагаемой к прибору инструкцией.

1. Подготовка прибора к работе

Установка ячейки. Открыть двери прибора. В промытую1 dH20 и высушенную ячейку вкрутить три чистые ферулы (верхняя, нижняя, капиллярная). Вставить ячейку в прибор по направляющим металлическим штырям.

Установка шприца. В чистый сухой шприц2 медленно набрать полимер (max 0,8 мл). Протереть шприц. Отвернуть лапку привода шприца на приборе влево. Вкрутить шприц в ячейку (правая верхняя).

Установка капилляра3. Открыть дверцу печки. Поместить конец капилляра в перекрестье каналов ячейки и закрепить боковой ферулой. Второй конец капилляра пропустить в отверстие шайбы крепления электрода и закрепить так, чтобы конец капилляра выступал на полмиллиметра. Расположить просвет капилляра напротив окна детектора, совместив метки, и закрыть крышку. Окончательно закрепить капилляр термо-скотчем и закрыть дверцу печки. Поместить свободный конец капилляра в буфер.

2. Запуск прибора

Включение прибора и заполнение ячейки. Включить прибор. Включить ПК. Запустить ПО – Data collection. Закрыть клапан буферной ячейки: Window>>Manual control>>Function>>Buffer valve close >>Execute. Закрутить верхнюю ферулу и открутить нижнюю. Продавить полимер до выхода из

13

отверстия нижней ферулы: Data collection>>Window>>Manual control>>Function>>Syringe down>>указать Value (для более короткого шага использовать shift down)>>Execute. Закрутить нижнюю и открутить верхнюю ферулу. Продавить полимер до выхода из отверстия верхней ферулы. Закрутить верхнюю ферулу и открыть клапан: Window>>Manual control>>Function>>Buffer valve open>>Execute. Продавить полимер до выхода из отверстия клапана. Закрыть клапан.

Калибровка и диагностика

Калибровка автосемплера: Data collection>>Window>>Manual control>>Autosample colabration>>Tray>>Снимаем адаптер>>Фиксируем капилляр на точке в соответствии с изображением на экране>>Start>>Page up поднимаем автосемплер вверх (shift up – более мелкие шаги), когда закончилось позиционирование, нажать set (нужно обращать внимание, какой текст отображается в диалоговом окне)>>Resume.

Диагностика детектора: Date collection>>File>>New Injection list>>SeQuensingtestsens, sss>>Modute>>Test CCD 4-colour>>Run.

Установка проб. Закрепить пробы на мягких септах. Нажать Tray. Собрать сендвидж и установить его в автосемплер. Нажать Tray. Закрыть дверцы прибора.

Включение печки: Data collection>>Window>>Manual control>>Temperature set>>Value 50>>Execute>>Window>>Status.

Запуск секвенирования: Data collection>>File>>New>>Sequence sample sheet на 96 образцов>>Sample name (назвать образцы, согласно занимаемому месту в штативе)>>Save as>>Закрыть все диалоговые окна для обновления полученной информации>>File>>New>>Injection list>>Выбирать созданный sample sheet (в дальнейшем будет пониматься, как матрикс)>>Выбрать module>>Задать условия электрофореза>>Run.

3. Завершение работы.

Открыть дверцы прибора. Изъять образцы: Tray>>Разобрать и промыть сендвидж>>Tray. Закрыть и выключить прибор.

Примечание:

1 Промывание ячейки. Отсоединить чашку с буфером и капилляр от ячейки, вынуть её из прибора. Последовательно промыть каналы ячейки dH20 через все ферулы пластиковым шприцем. Продуть каналы ячейки воздухом из шприца и дать высохнуть при комнатной температуре.

14

2Промывание шприца. Отвернуть лапку привода шприца на приборе влево. Data collection>>Window>>Manual control>>Function>>Syring home>>Execute. Открутить шприц, избавить от остатка полимера и десять раз промыть dH20. При необходимости перед промывкой можно разобрать шприц. Дать высохнуть при комнатной температуре.

3Капилляр вне упаковки и прибора хранить погруженным концами в деионизованную воду.

2.10. Протокол анализа результатов секвенирования

Использование программного обеспечения SeqA6. Запустить SeqA6. Загрузить данные: File>>AddSample(s)…>> в диалоговом окне выделить файлы сырых данных секвенирования с именами образцов, лежащих в папке с именем-

датой в директории «Runs»1 >>нажать кнопку «Add Selected Samples»>>Ok. В

открывшемся окне выбрать содержимое ячейки «DeySet/Primer» – подходящий набор химии и капилляр. Установить галочку в ячейке «Show». Нажать кнопку > (play). Во вкладке «Sequenсe» появится нуклеотидная последовательность образца. После анализа (см. инструкцию к ПО) сохранить последовательности образцов.

Использование BLAST. Открыть в браузере страницу http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Выбрать онлайн-приложение BLAST или перейти по ссылке > http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn& PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome. Скопировать последовательность образца из SeqA6 в соответствующее окно ресурса. Запустить анализ>>нажать <BLAST>.

Примечание:

1 Директория «Runs» обычно расположена по пути: <Корневой каталог>:\AppliedBio\310\Runs.

15

3. ОПИСАНИЕ НЕКОТОРЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ СЕЯНЦЕВ ЛЕСНЫХ ПИТОМНИКОВ, ВЫЯВЛЕННЫХ С ПОМОЩЬЮ МЕТОДОВ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА, И МЕТОДЫ БОРЬБЫ С НИМИ

Cladosporium sp. – анаморфные грибы, возбудители темно-оливковой плесени посадочного материала хвойных пород, также поражающие преимущественно ослабленные растения. Симптомами кладоспориоза являются изначальное потемнение хвои, приобретающей на последующих этапах патогенеза оливковый оттенок, и появление на поверхности тканей буровато-оливкового мицелия. Спороношение и, следовательно, заражение растений происходит в течение всего вегетационного периода при благоприятных для развития гриба условиях. Интенсивному распространению болезни способствуют повышенная влажность воздуха, часто выпадающие осадки, резкая смена суточных температур.

На начальном этапе развития болезни кладоспориоза (Cladosporium sp.) эффективным является использование фунгицидов на основе 12-оксофитодиеновой кислоты (12-oxo-PDA), что позволяет в полной степени оздоровить посадочный материал. В случае эпифитотий (распространение болезни на значительной территории) целесообразным является полное удаление поражённых сеянцев и отмерших растительных остатков. При этом следует производить уничтожение (сжигание) растительного материала за пределами питомника.

Грибы рода Alternaria являются возбудителями альтернариоза – сухой пятнистости хвои и листьев. Тёмно-коричневые или чёрные некротические пятна поражённых участков ткани могут появляться и на стебле. На поздних стадиях заболевания на поражённой хвое, которая становится бурой, на ветках появляется бархатистый налет мицелия чёрного цвета. Споры с пораженных участков тканей легко переносятся ветром на большое расстояние и становятся новым источником инфекции. Как правило, больные растения располагаются очагами. Спорообразованию способствует частая смена сухой и влажной погоды.

Растения, ослабленные неблагоприятными погодными или почвенными условиями, более восприимчивы к альтернариозу. Факторами, способствующими развитию альтернариоза, являются возможное нарушение агротехники выращивания, недостаток влаги в почве, низкое содержание азота

16

и калия, избыточное количество фосфора, а также поражённость семенного материала вирусами, ризоктониозом и другими болезнями.

Наиболее действенный метод защиты от альтернариоза химический. Защитные обработки против альтернариоза следует проводить после обнаружения первых симптомов заболевания. Высокую эффективность, по данным различных исследователей, показали фунгициды на основе дифолатана. В годы депрессивного развития альтернариоза достаточным является 1-2 обработки фунгицидами, в годы умеренного проявления болезни – 2-3, в эпифитотийные – 3-4.

Rhizosphaera kalkhoffii. Данный гриб вызывает побурение хвои. Заражение хвои происходит весной. Конидии распространяются посредством дождя. К концу лета или осенью на хвое побегов текущего года появляются отдельные жёлтые пятна. Постепенно они увеличиваются в размерах, становятся бурыми или красно-бурыми, и в конце зимы – начале весны вся хвоя буреет. Весной с нижней стороны хвоинок образуются чёрные округлые пикниды, располагающиеся продольными рядами. Конидии овальные бесцветные, размером (7-10) × (3-5) мкм, выходят из пикнид в виде мелких белых капель. В этот период пораженная хвоя опадает.

Распространение конидий и заражение хвои может осуществляться только в условиях повышенной влажности. Конидии возбудителя прорастают очень медленно, и поэтому заражение хвои возможно только при длительном её увлажнении. Систематически повторяющиеся поражения грибом R. Kalkhoffii приводят к ослаблению, реже к усыханию ее в питомниках и молодых культурах.

Средствами защиты от побурения хвои служит надзор за появлением и распространением данной болезни, т.к. обычно поражение вызывает общее ослабление растения и реже – усыхание. В случае острого протекания патологического процесса – опрыскивание растений в период вегетации водными суспензиями фундазола и бордосской смеси.

В лесных питомниках патоген Phoma pomorum вызывает заболевание фомоз (сухую гниль) посадочного материала хвойных пород. Заражение растений данным патогеном происходит в основном в период переувлажнённости почвы, через хвою, контактирующую с землёй. Затем патоген распространяется вдоль по стеблю и вызывает гибель верхушечной почки растения. На начальном этапе развития болезни преимущественно поражаются только ослабленные сеянцы и саженцы, в случае массовой

17

вспышки патогена инфицированию подвергается также и здоровый посадочный материал.

Для ограничения вредоносности Phoma pomorum наиболее эффективной является трёхкратная обработка вегетирующих сеянцев комплексом фунгицидных препаратов, содержащих хлороталонил или его аналоги. Вследствие того, что виды Phoma являются возбудителем заболеваний многих пропашных культур (например, патоген кукурузы Ph. pomorum), не рекомендуется выращивание посадочного материала или создание лесных культур на данных типах сельскохозяйственных земель без проведения предварительного севооборота.

Возбудитель склерофомоза имеет половую стадию, которая образуется на отмерших ветвях сосны, вызываемую грибом Sydowia polyspora. Вред, причиняемый болезнью, заключается в том, что в питомниках наблюдается отмирание сеянцев и снижается выход стандартного посадочного материала. В лесных культурах при сильном и неоднократном поражении деревья отстают в росте и часто становятся многовершинными.

От склерофомоза в условиях питомника рекомендуется сбор и удаление пораженных сеянцев в летний период. В лесных культурах целесообразно проводить обрезку поражённых склерофомозом ветвей.

Naemacyclus minor (или Cyclaneusma minus). Данный гриб вызывает пожелтение хвои. C. minus представляет большую потенциальную опасность для хвойных пород. В России указанный аскомицет относят к группе грибов возбудителей малоизученных болезней молодняков и взрослых хвойных насаждений. По литературным данным, гриб был обнаружен в окрестности г. Красноярска, Северном Казахстане, а также США (в штатах Северная Дакота, Южная Дакота, Небраска и Канзас) и Республике Беларусь. Этот вид гриба является инвазивным видом для лесов России.

Споры гриба распространяются посредством дождя и ветра. Споры заражают хвою через устьица с апреля по ноябрь. Гриб хорошо размножается на опавшей хвое. К концу лета или осенью на хвое побегов текущего года появляются отдельные светло-зелёные пятна. Постепенно они увеличиваются в размерах, и в конце зимы – начале весны вся хвоя желтеет.

Для ограничения вредоносности патогена Naemacyclus minor (или Cyclaneusma minus) наиболее эффективной является четырёхкратная, с апреля по октябрь, обработка вегетирующих сеянцев комплексом фунгицидных препаратов, содержащих хлороталонил или его аналоги.

18

Библиографический список

Основная литература

1.Лутова, Л. А. Биотехнология высших растений [Текст] : учеб. / Л. А. Лутова ; С.-Петерб. гос. ун-т. – Изд. 2-е, доп. и испр. – СПб. : СПбГУ, 2010. – 240 с.

2.Падутов, В. Е. Методы молекулярно-генетического анализа [Текст]

/В. Е. Падутов, О. Ю. Баранов, Е. В. Воропаев. – Мн. : Юнипол, 2007. – 176 с.

Дополнительная литература

3.Программа и Методика по п. 59 План мероприятий («дорожной карты») «Развитие биотехнологий и генной инженерии» [Текст] : [утверждён распоряжением Правительства РФ от 18 июля 2013 г. № 1247-р]. – Пушкино, 2013. – 205 с.

4.Лесной кодекс Российской Федерации. Комментарии [Текст] / под общ. ред. Н. В. Комаровой, В. П. Рощупкина. – Изд. 2-е, доп. – М. : ВНИИЛМ, 2007. – 856 с.

5.Молекулярно-генетическая диагностика грибных болезней в лесных питомниках [Электронный ресурс] / О. Ю. Баранов, В. А. Ярмолович, С. В. Пантелеев, Д. Г. Купреенко // Лесное и охотничье хозяйство. – 2012. – № 6. –

Режим доступа: http://scholar.google.com/.

6. Федоров, Н. И. Лесная фитопатология [Текст] : учеб. /

Н. И. Федоров. – Мн. : БГТУ, 2004. – 462 с.

7.Сенашова, В. А. Поражения филлосферы хвойных растений, вызванные фитопатогенными грибами на территории средней Сибири [Электронный ресурс] / В. А. Сенашова // Болезни и вредители в лесах России: ВЕК XXI : Материалы Всероссийской конференции с международным участием и V ежегодных чтений памяти О.А. Катаева. Екатеринбург, 20-25

сентября 2011 г. – Режим доступа: http://ipae.uran.ru/sites/default/files/publications /Zaharova_EJ/Zakharova_38.pdf

8.Гниненко, Ю. И. Cenangiumabietis в очагах массового размножения сосновой пяденицы в Северном Казахстане [Электронный ресурс] /

19

Ю. И. Гниненко, Н. Н. Арапова // I съезд микологов России. Тезисы докладов. –

Режим доступа: http://www.mycology.ru/nam/1crm/part3.pdf.

9.Мозолевская, Е. Г. Проблема инвазий возбудителей болезней и

вредителей древесных растений в Москве [Электронный ресурс] / Е. Г. Мозолевская, Э. С. Соколова // Чужеродные виды на территории России. –

Режим доступа: http://www.sevin.ru/invasive/publications/mozol_sokol_02_pr.html.

10.Synthetic molecular mimics of naturally occurring cyclopentenones exhibit antifungal activity towards pathogenic fungi [Text] / Y. Zhou [et al.] // Microbiology. – 2011. – № 157. – P. 3435-3445.

11.Жимулев, И. Ф. Общая и молекулряная генетика [Текст] : учеб. пособие / И. Ф. Жимулев. – Новосибирск : Сиб. унив. изд-во, 2006. – 479 с.

12.Генетические эффекты трансформации лесных экосистем [Текст] / В. Е. Падутов, Л. В. Хотылева, О. Ю. Баранов, С. И. Ивановская // Экологическая генетика. – 2008. – Т. VI. – № 1. – С. 3-11.

13.Состояние лесов Российской Федерации в 2013 году и прогноз на 2014 год [Текст] / ФБУ «Российский центр защиты леса». – Пушкино, 2014. – 45 с.

20

Приложение 1

Список оборудования для видовой идентификации фитопатогенов сеянцев лесных питомников с помощью молекулярно-генетических методов анализа