3277

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ

УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

Воронежский государственный лесотехнический университет им. Г.Ф. Морозова

Экологическая биотехнология

Методические указания для самостоятельной работы студентов

по направлению подготовки 19.03.01 – Биотехнология

Воронеж 2017

Брындина Л. В. Экологическая биотехнология : методические указания для самостоятельной работы студентов по направлению подготовки 19.03.01

– Биотехнология [Текст] / Брындина Л.В.; М-во образования и науки РФ, ФГБОУ ВПО «ВГЛТУ им. Г.Ф. Морозова», – Воронеж, 2017. – 42с.

Тема 1. Экологические аспекты биотехнологии.

-основные биохимические пути микробиологической трансформации органических ксенобиотиков;

-факторы окружающей среды и биодоступность ксенобиотиков;

-особенности микробиологической трансформации отдельных классов органических ксенобиотиков;

-биотрансформация ксенобиотиков водорослями и растениями;

-биотрансформация соединений азота, серы, металлов;

-транслокационная миграция тяжелых металлов и радионуклидов в растения;

-накопление загрязнений гидробионтами.

Поступающие в окружающую среду ксенобиотики подвергаются биообезвреживанию несколькими путями. В зависимости от конечного результата превращения тех или иных веществ различают полную деградацию (минерализацию, полную деструкцию), неполную деградацию (трансформацию, частичную минерализацию, частичную деструкцию), связывание поллютантов или их метаболитов с другим веществом — матрицей (полимеризация, конъюгация, конденсация).

Биодеструкция (биоразрушение, биодеградация) — это превращение сложных веществ с помощью биологических агентов (живых организмов). Основными биологическими агентами, которые осуществляют биодеструкцию, являются микроорганизмы, имеющие огромное разнообразие ферментных систем и большую лабильность метаболизма. Именно они способны разлагать широкий спектр химически стойких соединений, тем самым возвращая основные пищевые элементы в глобальные циклы и предотвращая накопление «мертвых» остатков на поверхности Земли.

Полная деградация соединения микроорганизмами происходит в случае, если оно обладает свойством биодоступности (способно использоваться в качестве источника углерода и энергии или в процессах кометаболизма). Полное разрушение стойких органических ксенобиотиков в природе происходит, как правило, в результате совместного действия сообщества организмов и абиотических факторов. Микробная минерализация является наиболее эффективным и экологически приемлемым способом удаления органических ксенобиотиков из окружающей среды.

В процессе биодеградации (минерализации) различают две стадии: 1)первичное биоразложение, при котором молекула трансформируется под действием микроорганизмов с образованием соединений, которые не проявляют характерных свойств трансформируемого вещества (например, токсичности для пестицидов).

2)полное биоразложение, когда молекула ксенобиотика превращается в минеральные вещества и продукты, связанные с нормальными метаболическими процессами микроорганизмов.

Процессы биодеградации ксенобиотиков обычно приводят к их обезвреживанию (детоксикации). Процесс утраты токсикантом токсичности в результате биотрансформации называется метаболической детоксикацией. Но возможно и противоположное явление, когда в процессе биотрансформации нетоксичный или малотоксичный ксенобиотик становится токсичным, обладающим канцерогенными или мутагенными свойствами и может накапливаться в окружающей среде. Такая биотрансформация приводит к токсификации (биоактивированию) вещества. Явление токсификации известно при трансформации некоторых пестицидов (в результате изомеризации, алкилирования, окисления, восстановления, конъюгации), ароматических аминов (при гидроксилировании), соединений, содержащих ароматические нитро- и азогруппы (с образованием нитрозосоединений), ароматических соединений (образование эпоксидов), при превращении связи P = S в связь Р = О (при окислении фосфотионатов). К таким веществам относятся пестициды пропанид и диурон, продуктом биотрансформации которых является более токсичный и стойкий 3,4- дихлоранилин.

Термин трансформация (неполная, частичная деструкция) чаще всего используют для обозначения превращений, которые существенно изменяют, главным образом упрощают, структуру органического вещества, но не приводят к его полной деструкции. Трансформация органических соединений может сопровождаться частичной их минерализацией, например в результате реакций дезаминирования, декарбоксилирования. Под биотрансформацией подразумевают изменение органических соединений под действием одного или нескольких ферментов микроорганизмов, сопровождающееся накоплением в среде продуктов трансформации, при этом не происходит синтеза веществdе novo.

Биотрансформация может приводить к полимеризации (конъюгации). При этом сохраняется основная структура органического соединения, происходит его связывание с другим соединением с образованием продукта с большей молекулярной массой. Полимеризация наблюдается, например, в почве при гумификации и включении связанных остатков ксенобиотиков в почвенную матрицу.

Под биодоступностью понимают способность различных соединений подвергаться биотрансформации. Биодоступность определяется генетическими свойствами организмов, осуществляющих трансформацию поступающих в организм веществ, условиями окружающей среды, влияющими на скорость переноса соединений в организмы или клетки, токсичностью соединений для организма-мишени и их концентрацией в окружающей среде. В зависимости от времени полураспада t1/2 химические соединения классифицируют на легко доступные (t1/2 от 1 до 7 сут.),

умеренно доступные (t1/2 от 7 сут. до 4 нед.), трудно доступные (t1/2 от 4 нед. до 6 мес.), устойчивые (t1/2 от 6 мес. до 1 года).

Условия окружающей среды играют важную роль в процессе деградации ксенобиотиков микроорганизмами-деструкторами. Биодоступность и активность биодеградации соединения ограничивают следующие факторы:

1.Неоптимальное значение или отсутствие какого-либо фактора, необходимого для роста микроорганизмов-деструкторов:

•низкая концентрация ксенобиотика для индукции ферментов метаболизма;

•физическая недоступность загрязнения из-за его адсорбции, связывания, механического включения, низкой растворимости;

•недоступность акцепторов электронов или субстратов;

•дефицит элементов питания;

•неоптимальные температура, влажность, рН, Eh и др.

2.Инактивация необходимых внеклеточных ферментов.

3.Токсическое действие окружающей среды, обусловленное токсичностью ксенобиотика или органическими ингибиторами, генерируемыми другими биологическими системами, а также токсинами микроорганизмов.

Тема 2. Главные биологические агенты экологической биотехнологии.

-рекомбинантные штаммы микроорганизмов-биодеструкторов;

-физиология и способы культивирования микробных культур для разложения и детоксикации загрязнителей воздушной среды;

-системы очистки со взвешенными и неподвижными клетками микроорганизмов;

-метод адаптированных культур;

-роль ферментов микроорганизмов в процессе очистки; экобиотехнологические аспекты производства и применения ферментных препаратов;

-экологические функции растений;

-биоконверсия отходов переработки натуральных волокон животного происхождения.

Основная роль в биодеструкции органических загрязнителей принадлежит микроорганизмам, особенно бактериям, синтезирующим разнообразные ферментные системы. К микроорганизмам-деструкторам относят значительную часть всего микробиоценоза, доля деструкторов еще больше в искусственно созданных экосистемах, направленных на очищение сред — аэротенках, метантенках, полях фильтрации и др.

В настоящее время известно большое количество видов микроорганизмов, принадлежащих к бактериям, дрожжам, грибам, способных к утилизации нормальных и разветвленных, насыщенных и ненасыщенных углеводородов, циклических углеводородов, ПАУ, ПАВ, пестицидов, галогенорганических соединений. Микроорганизмы — деструкторы органических загрязнителей известны среди представителей родов бактерий Pseudomonas, Rhodococcus, Azotobacter, Bacillus, Arthrobacter, Acinetobacter, Zooglea, Nocardia, дрожжей Yarrowia, Candida, Torulopsis, Сryptococcus, Rhodotorula, Pichia, грибов Aspergillus, Cladosporium, Verticillium, Alternaria, Fusarium. Известны деструкторы среди цианобактерий: Agmenellum, Anabaena, Oscillatoria, Microcoleus, Phormidium, Nostoc. Но цианобактерии не способны к полной минерализации загрязнителей, их роль заключается в синтезе полисахаридов, способствующих образованию эмульсии ПАУ, других нефтепродуктов и загрязнителей в воде, что является первым шагом к биодеструкции. Продуцируемые цианобактериями внеклеточные полисахариды привлекают бактериальные клетки, формирующие разнообразную сопутствующую микробиоту. Ассоциативные с водорослями бактерии, цианобактерии входят в альгобактериальное сообщество, функционирующее как надорганизменная система, что способствует более эффективной биодеградации ксенобиотиков. Смешанные популяции, как правило, быстрее и полнее разрушают многие синтетические соединения. Это характерно для ситуации, когда отдельный вид организмов трансформирует одно соединение в другое, но не имеет ферментативной системы для его дальнейшей деградации. Этой споcобностью обладает другой организм, в результате соединение разлагается полностью.

Способность к биодеструкции в биоценозе зависит от состава и разнообразия фито-, микроценоза, скорости роста организмов, обмена питательными веществами и генетическим материалом. Накапливаемые метаболиты могут быть токсичны для одного компонента сообщества и усваиваться другими микроорганизмами, что ускоряет в совокупности процесс разложения (феномен детоксификации).

Самоочищение природных экосистем от загрязнителей с помощью микроорганизмов подтолкнуло к их выделению и дальнейшему усовершенствованиюсцельюнаправленногоиспользованиядлябиодеструкции конкретных ксенобиотиков. Разработка таких биологических способов очистки на основе штаммов-деструкторов способна существенно интенсифицировать процессы восстановления природной среды. Эффективность селекции микроорганизмов-деструкторов повышается, если придерживаться следующих принципов:

•выделять монокультуры или сообщества микроорганизмов (изоляты) из сред, загрязненных теми или иными ксенобиотиками;

•использовать биологический агент, изолированный из той же загрязненной природной или техногенной среды, для очистки которой он предназначен;

ДНК и способны стабильно и автономно существовать в клетке в характерном для каждого типа плазмид числе копий. Саморепликация плазмиды осуществляется с помощью ферментных систем клетки-хозяина. Плазмиды относятся к подвижным элементам (векторам), т. е. способны к внутривидовому переносу между клетками популяции, клетками различных видов и родов микроорганизмов.

Новые сочетания генов, получаемые в результате внутри- и межплазмидной рекомбинации, между плазмидой и хромосомой хозяина, могут приводить к возникновению новых комбинаций генов и распространению катаболических путей деградации, кодируемых плазмидами (модулярная эволюция).

Поскольку кольцевая хромосома бактерий содержит ограниченное количество генов, она обеспечивает основной метаболизм бактерий, их развитие в благоприятных условиях. При изменении условий выживание популяций бактерий обеспечивается наследственными элементами в форме подвижных, легко передаваемых структур, которые кодируют биосинтез ферментов, необходимых для существования бактерий в изменившихся условиях обитания. Например, один из выделенных штаммов бактерии Pseudomonas оказался способным использовать более 100 видов органических соединений. Бактериальная хромосома не может содержать все гены, ответственные за синтез ферментов, необходимых для деградации такого большого количества соединений. Очевидно, что в этом случае метаболизм большинства соединений осуществляется при участии ферментов, кодируемых плазмидами.

Плазмиды обладают изменчивой структурой и существуют в стабильной форме только в том случае, если этому способствуют условия среды. Например, когда с определенной плазмидой связана катаболическая функция, присутствие субстрата-ксенобиотика стабилизирует ее структуру в процессе популяционной автоселекции. При отсутствии селективного давления (ксенобиотика) автономные плазмиды быстро элиминируются, но стабильны после включения их в хромосому. Особенности генетического аппарата бактерий и механизмы горизонтального переноса генов обеспечивают необходимую пластичность генома и включения в метаболизм ксенобиотиков, адаптацию к различным соединениям и быстрое распространение необходимых генов внутри популяции.

Некоторые плазмидные системы хорошо изучены, например, контролирующие окисление толуола, о-,м-,п-ксилолов,нафталина,3- хлорбензоата,2,4-дихлорфеноксиацетата.Системы биодеградации таких соединений, как камфора иналканы, изучены недостаточно из-за очень больших размеров соответствующих плазмид (до 500 тыс. пар нуклеотидов).

Благодаря плазмидам как объектам генной инженерии с помощью рестриктаз возможно in vitro сконструировать dе novo геном клетки, передать его в клетки реципиентов конъюгацией, трансформацией или трансдукцией и при включении в клетку большого числа плазмидных копий увеличить число необходимых генов. В последнее время созданы банки векторов и носителей, позволяющие конструировать штаммы, способные к биодеструкции ксенобиотиков при различных условиях среды и содержащие не только гены деструкции, но и, например, гены синтеза био-ПАВ или фермента люциферазы, что улучшает биодоступность ксенобиотиков и облегчает наблюдение за рекомбинантными штаммами в окружающей среде.

Недостатком в конструировании микроорганизмов является нестабильность систем «хозяин — вектор», что затрудняет интродукцию штаммов в естественную среду. При возвращении микроорганизма с новой катаболической функцией в исходную природную среду ему приходится конкурировать с хорошо адаптированной к данным условиям среды естественной микробиотой, сталкиваться с огромным разнообразием источников углерода, в том числе высокотоксичных.

В микробной утилизации поллютантов принципиальное значение имеют выживаемость и конкурентоспособность микроорганизмовдеструкторов, интродуцируемых в места загрязнения in situ. Использование катаболических генов представляется перспективным направлением биоремедиации, поскольку даже в том случае, если интродуценты неконкурентоспособны и постепенно элиминируются, тем не менее, они могут быть донорами генов биодеградации вследствие конъюгационного переноса плазмид. Катаболические плазмиды с генами, кодирующими биохимические пути микробной деградации поллютантов, и другие мобильные генетические элементы, способные повышать эффективность штаммов-деструкторов за счет приобретения ими новых катаболических способностей, являются позитивным фактором, который при продуманном использовании может способствовать решению ряда экологических проблем.

Тема 3. Защита гидросферы.

При изучении данной темы самостоятельно рекомендуется рассмотреть следующие вопросы:

-поверхностные и подземные водные среды;

-взвешенное, растворенное, органическое вещество водных сред;

-биота природных водных сред, экосистемы болот.

-способы очистки сточных вод,;

-аэробный и анаэробный методы очистки сточных вод;

-технологии очистки сточных вод от трудноразлагаемых соединений;

-обеззараживание и обезвреживание осадков сточных вод;

-выделение металлов из растворов, борьба с биообрастаниями.

Ктяжелым металлам относят более 40 металлов с атомной массой свыше 50 атомных единиц. Практически все элементы, относящиеся к группе

тяжелых металлов, являются биологически активными. Такие металлы, как Mn, Ni, Сu, Сr, Со, V, Zn, Fe и Мо, входят в состав ферментов или их активаторов и необходимы для жизнедеятельности организмов. Однако эти металлы необходимы в весьма незначительных (следовых) количествах, а при более высоких концентрациях становятся токсичными и канцерогенными. Попадая в живой организм, многие из них склонны к накоплению (аккумуляции), проявляя при этом как синергизм, так и антагонизм совместного воздействия.

Источниками поступления тяжелых металлов могут быть факторы природного (выветривание горных пород и минералов, эрозионныепроцессы,вулканическаядеятельность)итехногенногопроисхожде ния (добыча и переработка полезных ископаемых, сжигание топлива, влияние транспорта, сельского хозяйства). Часть техногенных выбросов, поступающих в окружающую среду в виде тонких аэрозолей, переносится на значительное расстояние и вызывает глобальное загрязнение. Другая часть поступает в бессточные водоемы, где тяжелые металлы накапливаются и становятся источником вторичного загрязнения.

Токсичность и биодоступность металла зависят от реакционной способности и растворимости, т. е. химической формы элемента. Форма каждого элемента связана с его степенью окисления и физическим состоянием (находится металл в свободном состоянии или включается в состав комплексов, неорганических или органических частиц, минералов, конкреций и т. п.). Повышение концентрации тяжелых металлов в природных водах часто связано с другими видами загрязнения, например, с закислением.

Выпадение кислотных осадков способствует снижению значения рН и переходу металлов из сорбированного на минеральных и органических веществах состояния в свободное. Возможны одновременно несколько путей распределения металла при попадании в экосистемы.

Клетки микроорганизмов способны концентрировать значительные количества металлов из среды, независимо от того, имеют ли эти металлы физиологическое значение или их участие в метаболических процессах не установлено. Практически во всех случаях микробная биомасса может удерживать более или менее значительные количества ионов металлов путем «пассивной» сорбции и/или комплексообразования. Такой тип взаимодействия получил название биосорбция и характерен как для живых, так и для мертвых клеток. Наиболее полно поглощаемыми микробиотой металлами из водной фазы являются Zn, Sr, далее Ni, Cu, Pb, Co, Cd. Физиологическое взаимодействие микроорганизмов с ионами металлов может протекать по одному из нескольких механизмов: физической или химической адсорбции, пассивной или энергозависимой аккумуляции клеткой, детоксикации металла при протекании окислительновосстановительных реакций, внеклеточному осаждению с продуктами метаболизма или кластеризации.