2882

Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего образования «Воронежский государственный лесотехнический

университет им. Г.Ф. Морозова»

БИОТЕХНОЛОГИЯ В ЛЕСНЫХ КУЛЬТУРАХ

Методические указания для самостоятельной работы аспирантов по направлению 35.06.02 - Лесное хозяйство (направленность программы - Лесные культуры, селекция, семеноводство)

Воронеж 2017

1

УДК630*165.6: 631.147(075.8)

Биотехнология в лесных культурах.[Электронный ресурс] Методические указания для самостоятельной работы аспирантов по направлению 35.06.02 - Лесное хозяйство (направленность программы - Лесные культуры, селекция, семеноводство)/ А. И. Сиволапов, И.Ю. Исаков; Мин-во обр. и науки РФ, ФГБОУ ВО «Воронеж. гос. лесотехн. университет им. Г.Ф. Морозова». Воронеж, 2017. – 16 с.

Печатается по решению редакционно-издательского совета ВГЛТУ им. Г.Ф. Морозова.

Рецензент канд. биол. наук, зав лабораторией лесной биотехнологии ВНИИЛГИСбиотех О.С. Машкина

2

ВВЕДЕНИЕ

Биотехнология – наука о методах и технологиях создания и использования генетически трансформированных биологических объектов (растений, животных и микроорганизмов) для интенсификации производства или создания новых продуктов различного назначения.

Биотехнология в лесных культурах для аспирантов по специальности 06.03.01 предусматривает изучение трех разделов дисциплины:

-микроклональное размножение растений с использованием биотехнологии in vitro;

-применение метода ДНК-анализа для изучения биоразнообразия и генетической паспортизации сортов древесных растений;

-биотехнология in vitro в лесокультурной практике.

Поэтапные вопросы биотехнологии in vitro рассматриваются на базе Питомнического хозяйства ВГЛТУ.

Применение ДНК-анализа рассматривают на базе отдела генетики Воронежского филиала Центра защиты леса.

Практическое внедрение биотехнологии in vitro в лесокультурной практике рассматривается на базе Учебно-опытного лесхоза ВГЛТУ.

Биотехнологический процесс включает следующие компоненты: биологический агент, субстрат, целевой продукт, аппаратуру и совокупность управляющих ими методов. Регенерация – восстановление целого организма из его части. Наиболее сложной является регенерация растений из отдельных клеток. Особенно трудно этот процесс происходит у древесных растений.

Академическое изучение дисциплины ориентировано на теоретические знания и подготовку аспирантов для научных исследований. Центральными элементами подготовки являются новые полученные знания, новейшие научные познания и обучение, ориентированное на решение проблем. Аспиранты работают с новыми методами исследования и вовлечены в исследовательскую работу.

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ОРГАНИЗАЦИИ ИЗУЧЕНИЯ ДИСЦИПЛИНЫ

1. Самостоятельная работа аспирантов

Аспиранты преимущественно изучают отдельные вопросы науки самостоятельно.

Лекции дают достаточно в полном объеме содержание дисциплины, но для глубокого изучения отдельных вопросов необходимо самостоятельное изучение литературных источников.

Лектор сообщает аспирантам содержание разделов по дисциплине и рекомендует литературу для изучения. Кроме теоретических вопросов

3

преподаватель демонстрирует методики проведения исследований применения биотехнологии в лесокультурной практике.

Тема 1. Основные положения «Комплексной программы развития биотехнологии в Российской Федерации до 2020 года», принятой 14 апреля 2012 года Правительством РФ по лесной биотехнологии

Цель работы: изучить основные положения Программы развития лесной биотехнологии в РФ, планы реализации, какое значение придается биотехнологии в развитии страны и лесного хозяйства.

Методические рекомендации

В процессе проработки темы необходимо уяснить современное состояние в области лесной биотехнологии. В процессе работы ознакомиться с основными положениями Приоритетного направления Программы № 7 – Лесная биотехнология.

Реализация Программы в части приоритетного направления "Лесная биотехнология" приведет к созданию в стране современной системы управления лесонасаждениями с привлечением методов ДНК маркирования, созданию новых биотехнологических форм деревьев с заданными признаками, развитию плантационного лесовыращивания, созданию условий для малоотходной переработки древесины, утилизации отходов лесопиления, а также к созданию спроса на современные экологически безопасные средства защиты леса.

7.1"Применение биотехнологий для управления лесонасаждениями"

Одним из приоритетных направлений развития лесных биотехнологий является молекулярное (ДНК) маркирование, направленное на решение следующих задач лесного хозяйства и промышленности:

- совершенствование принципов и подходов лесосеменного районирования;

- генетическая паспортизация и сертификация семян; - мониторинг фитосанитарного состояния питомников и

лесонасаждений; - контроль законности происхождения древесины.

Таким образом, комплекс мероприятий направлен на разработку и ускорение распространения передовых технологий, а также широкое применение биотехнологий в целях повышения эффективности управления лесонасаждениями.

7.2"Применение биотехнологий для сохранения и воспроизводства лесных генетических ресурсов"

Современные методы лесной биотехнологии позволят эффективно проводить мониторинг состояния ресурсов, сохранять и воспроизводить лесные генетические ресурсы. К таким биотехнологиям относятся следующие:

- создание банков in vitro редких и исчезающих видов лесных растений;

4

-клональное микроразмножение редких и исчезающих видов лесных древесных и травянистых растений для создания резерватов;

-мониторинг состояния лесных генетических ресурсов с применением методов анализа ДНК;

-оценка генетического разнообразия лесных насаждений с использованием методов анализа ДНК.

7.3 "Создание биотехнологических форм деревьев с заданными признаками"

Экономическая эффективность лесонасаждений (лесных плантаций в частности) в первую очередь зависит от продуктивности и устойчивости к биотическим и абиотическим факторам среды используемых лесных пород.

Всвою очередь эти характеристики зависят от генетической ценности и качества посадочного материала. Необходимо развивать биотехнологии, направленные на создание новых форм лесных пород с заданными признаками. К таким биотехнологиям относятся следующие:

-селекция основных лесообразующих пород на основе ДНК маркирования для выведения новых гибридных и сортовых форм;

-создание биотехнологических форм деревьев с заданными признаками, например, с пониженным содержанием лигнинов, устойчивостью к гербицидам;

-клональное микроразмножение генетически ценных форм деревьев с целью быстрого выведения на рынок новейших селекционных достижений и повышения качества посадочного материала.

Биотехнологические формы деревьев являются сырьевой базой современной лесоперерабатывающей промышленности. Значительная часть расходов в процессе переработки древесины приходится на отделение древесной целлюлозы от лигнина, который представляет собой вещество, связывающее волокна древесины. При этом используются едкие щелочные растворы, высокие температуры и давление. Использование древесины, содержащей меньше лигнина и больше целлюлозы, существенно повышает конкурентоспособность лесоперерабатывающей промышленности.

Быстрорастущие деревья являются также одним из эффективных способов борьбы с изменением климата в качестве поглотителей углекислого газа. Другим направлением использования быстрорастущего леса является его использование в качестве сырья для биотоплива.

7.4 "Биологические средства защиты леса"

Применение средств химии губительно сказывается на биоразнообразии лесных сообществ, а отсутствие работ по созданию и производству новых биологических средств защиты (включая микробиологические и энтомофаги) не позволяет сдерживать распространение в лесах новых опасных вредителей и фитопатогенов фитофагов, что негативно влияет на пожарную безопасность в лесах и приводит к значительным социально-экономическим ущербам от пожаров. Комплекс мероприятий направлен на изыскание биотехнологических средств

5

защиты, перспективных для использования в защите леса и разработку на их основе технологий получения и применения экологически безопасных средств защиты леса от вредных организмов. Реализация указанного комплекса мероприятий позволит восполнить отсутствие биологических средств для защиты леса в стране и будет содействовать созданию в России их малотоннажных производств.

Увеличение числа биологических средств для защиты леса и расширение сферы их применения позволит снизить как социальноэкономические потери от вспышек массового размножения вредных организмов, так и пестицидную нагрузку на леса, содействуя сохранению биологического разнообразия.

Впроцессе ознакомления с программой рекомендуется обратить внимание на целевые показатели программы, создание базы для повышенного потенциала генетических ресурсов древесных растений.

Врезультате реализации Программы в России будет создана современная база промышленного производства, характеризующаяся повышенным ресурсным потенциалом лесов и существенно сниженным уровнем безвозвратных отходов лесного производства.

Тема 2. История развития биотехнологии в лесоводстве и связь с другими науками.

Цель работы: ознакомиться с обзором исторического развития биотехнологии, еѐ связи с другими науками. Биотехнология в лесоводстве.

Методические рекомендации

При проработке темы необходимо усвоить основные этапы развития биотехнологии, ее связи с другими дисциплинами, краткой историей развития науки. Доисторические времена: домашние животные и культурные растения. Влияние греческой культуры: Гиппократ и Аристотель. 1600-1850- е годы: на заре современной биологии. Чарльз Дарвин и эволюция. Генетика, технология и общество. Первые биотехнологические процессы, используемые человечеством: брожение и окисление. Биотехнология и общество: евгеника и эуфеника. Генетика и биотехнология: теоретические и практические аспекты. Теория преформации. Теория случайного зарождения организмов из неживых компонентов. Карл Линней и его теория постоянства видов. Достижения биотехнологии в сельском и лесном хозяйстве.

Особенно внимательно следует определить роль и место в практике лесного хозяйства, биотехнологии лесных растений как части лесного ресурсоведения. Аспиранту необходимо ознакомиться с основными разделами фундаментальной биотехнологии: классической (формальной) биотехнологии, цитогенетики, молекулярной биотехнологии, биотехнологии ферментов и иммунобиотехнологии, биотехнологии мутагенеза, радиационной и химической биотехнологии, эволюционной биотехнологией, геномикой и эпигеномикой, биотехнологии индивидуального развития и эпигенетикой, экологической биотехнологии и биотехнологической токсикологией, биотехнологией индивидуального развития.

6

Тесты для самоконтроля: Сравните теорию эпигенеза и преформации; Какие идеи положены Дарвином в основу его теории; В чем суть центральной догмы молекулярной биотехнологии и почему она лежит в основе этой науки; Назовите четыре основных метода исследований в биотехнологии; Расскажите о биотехнологических исследованиях в области лесного хозяйства и медицины.

Тема 3. Биотехнология и генная инженерия Цель работы: уяснить цели и задачи современной биотехнологии,

ознакомиться с еѐ задачами и структурой, еѐ место в лесоводстве.

Методические рекомендации

При работе над темой следует иметь в виду, что биотехнология изучает все уровни организации живых организмов – молекулярный, цитологический, тканевый, организменный, надорганизменный, популяционный. Детально изучить: основы биотехнологии, определение биотехнологии, задачи биотехнологии, структуру современной биотехнологии, биотехнологию низкого уровня, биотехнологию высокого уровня: микробиологический синтез, клеточную и генную инженерию.

В заключении ознакомиться с задачами и методами генной инженерии, генетически модифицированных (трансгенных) организмов и генетически модифицированных источников, основными способами получения трансгенных клеток и организмов; их сравнительной характеристикой, с достижениями генной инженерии, перспективами развития генной инженерии, этическими и технологическими проблемами генной инженерии. Опыты получения генмодифицированных древесных растений.

Тесты для самоконтроля: Дать определение биотехнологии; Что такое цветные биотехнологии и их предназначение; Рассказать о целях зеленой биотехнологии; Рассказать о задачах красной, белой, коричневой, синей биотехнологиях; Понятие о трансгенных организмах.

Тема 4. Этапы развития биотехнологии древесных растений. Значение и функции протопластов.

Цель работы: Изучить основные этапы развития и достижения лесной биотехнологии, виды деревьев, введенных в культуру тканей, основными типами эксплантов и типах тканевых культур.

Методические рекомендации

При изучении характеристик основных этапов развития биотехнологии древесных растений необходимо знать основные проблемы работы с древесными растениями – длительный онтогенез, сложность введения эксплантов со взрослых деревьев. Важно знать определение «каллус», «каллусная ткань» а также методы индукции (получения) каллусогенеза у растений, запомнить виды древесных растений, введенных в культуру in vitro (тополь, ива, эвкалипт, сосна, береза, липа и др.), особенности строения и морфологии каллуса, индукцию и культивирование суспензионной клеточной культуры. Особое внимание уделить значению протопластов для

7

прикладных и фундаментальных исследований, основным способам получения протопластов, способы культивирования и слияния протопластов.

Тесты для самоконтроля: Дать определение лесной биотехнологии; Назвать виды лиственных древесных растений, используемых в настоящее время в биотехнологии; назвать виды хвойных древесных растений, используемых в биотехнологии; назвать виды декоративных древесных и кустарниковых пород, используемых в биотехнологии; привести алгоритм введения в культуру ткани карельской березы, тополя белого, сереющего, ольхи черной и серой.

Тема 5. Методы биотехнологии.

Цель работы: Изучить основные методы биотехнологии, их применимость к отдельным видам деревьев.

Методические рекомендации

Вначале необходимо ознакомиться с основной задачей генной технологии - создание новых комбинаций наследственного материала в целых клетках микроорганизмов, грибов, растений и животных с последующей передачей введенной информации дочерней клетке.

При изучении данной темы следует уяснить следующие наименования и области их применения: Пути введения генов, методика генной инженерии, роль плазмид в этом процессе, виды используемых плазмид – агробактериальные и ризобиальные, изучить Закон РФ «О санитарноэпидемиологическом благополучии населения» об условиях работы в области генной инженерии.

К методам биотехнологии относится клеточная инженерия. Аспиранту важно уяснить типы клонирования культур тканей и клеток высших растений, соматическую гибридизацию клеток растений, особенности культивирования клеток растений. В качестве расширения кругозора следует знать инженерию культур клеток животных и человека: клонирование, трансплантацию эмбрионов, создание гибридов, особенности культивирования клеток животных.

Атакже получение медицинских препаратов и лекарственных веществ

спомощью микроорганизмов и культур тканей.

Тесты для самоконтроля: Охарактеризуйте метод генной инженерии; Что такое плазмиды? Какова их роль в генной инженерии? Для каких целей в генной инженерии применяются ферменты рестриктазы? Лигазы? В чем заключается сущность метода клонирования растений? Для каких целей применяются методы клонирования? В чем заключается метод соматической гибридизации клеток? В чем сущность метода трансплантации эмбрионов? Охарактеризуйте гибридомную технику; Для каких целей применяют методы трансплантации эмбрионов и гибридомную технику? Охарактеризуйте методы получения гормонов, ферментов, интерферонов.

Тема 6. Индукция морфогенеза in vitro.

Цель работы: определить роль и место внешних (средовых) и

8

внутренних (генотипических) факторов при введении в культуру ткани.

Методические рекомендации

Изучение темы необходимо начать со значения происхождения экспланта для индукции процессов регенерации in vitro. Важно знать, что правильный выбор меристематической (образовательной) ткани в растении является одним из важнейших факторов дальнейшей успешной процедуре работы с ним. Также важно понимать роль компонентов питательной среды,

культивирование морфогенеза in vitro также сильно влияет на результат взаимодействия экспланта с питательной средой.

Тесты для самоконтроля: Виды эксплантов у лиственных древесных растений; Виды эксплантов у хвойных древесных растений; Роль макросолей в питании растений; Роль микросолей в питании растений; Веществаотвердители, используемые при создании искусственных питательных сред в биотехнологии;

Сахара, используемые при приготовлении искусственных питательных сред; Влияние освещенности, влажности и температуры на рост эксплантов.

Тема 7. Пути биосинтеза фитогормонов.

Цель работы: Изучить основные пути биосинтеза и транспортировки основных групп фитогормонов в растении.

Методические рекомендации

Студенту при проработке этой темы необходимо знать определение и функции фитогормонов. Они имеют следующие особенности: 1. Эндогенное происхождение. 2. Способны перемещаться по растению. 3. Вызывают ростовые и формативные эффекты в малых концентрациях (10-12 – 10-7 М) а также понимать: пути биосинтеза и катаболизма ауксина, его химическую формулу, пути биосинтеза и катаболизма другой группы фитогормонов - цитокининов, структурную формулу цитокининов.

При изучении путей биосинтеза и катаболизма гиббереллинов нужно знать их функциональную нагрузку, а именно – они были обнаружены

структурную формулу гиббереллинов, пути биосинтеза и катаболизма абсцизовой кислоты, структурную формулу абсцизовой кислоты.

Пути биосинтеза и катаболизма этилена. Структурная формула этилена. Пути биосинтеза брассиностероидов. Структурная формула брассинолида и кастастерона. Жасминовая кислота, салициловая кислота, их строение и функции.

Тесты для самоконтроля: Рассказать о химических формулах и путях биосинтеза цитокининов на примере зеатина; Рассказать о химических формулах и путях биосинтеза гиббереллинов на примере гибберелловой кислоты.

9

Тема 8. Локализация биосинтеза фитогормонов в растении.

Цель работы: уяснить локализацию ауксина, гиббереллинов, цитокининов, абсцизовой кислоты, этилена.

Методические рекомендации

При изучении данного вопроса следует обратить внимание на локализацию биосинтеза фитогормонов. Поскольку у них разные функции, то и локализация у них разная. Ауксин, локализация. Локализация биосинтеза в клетках и частях растений цитокининов.

Далее необходимо ознакомиться с локализацией биосинтеза в клетках и частях растений гиббереллинов, абсцизовой кислоты.

Локализация биосинтеза в клетках и частях растений этилена, брассиностероидов.

Тесты для самоконтроля: В каких частях (органах) растений производится сборка ауксинов? Цитокининов? Гиббереллинов? Этилена и абсцизовой кислоты? В какие органы они перемещаются? Физиологические эффекты ауксинов, цитокининов, гиббереллинов, абсцизовой кислоты, этилена, брассиностероидов. Конъюгирование, первичные акцепторы, действие на рост и развитие растений. Виды взаимоотношений между группами фитогормонов – антагонизм, синергизм.

Тема 9. Методы селекции и регенерации растений.

Цель работы: уяснить цели создания объектов ЕГСК и воссоздание редких генотипов деревьев методами культуры тканей.

Методические рекомендации

При изучении современного состояния биотехнологии необходимо понимать, что важной составляющей биотехнологического процесса является отбор необходимых для массового получения форм (видов) деревьев. Ориентироваться в возрасте деревьев, с которых должен быть взят материал для размножения. Поэтому студент должен знать: понятие о генофонде лесных древесных растений, пути сохранения генофонда – in situ и ex situ, Объекты Единого Генетико-Селекционного Комплекса (ЕГСК): Архив клонов, географические культуры, испытательные культуры, особо охраняемые природные территории (ООПТ), памятники природы, культуры экзотов, культуры интродуцентов, гибридные плантации, плантационные культуры.

Тесты для самоконтроля: Охарактеризовать каждый из объектов ЕГСК, из каких пород он создается, для каких целей. Дать определение архива клонов. Для чего создаются географические культуры? В чем особенность закладки испытательных культур? Ведение хозяйства на ООПТ. Что может служить памятником природы? Экзоты, интродуценты, гибриды – их значение для науки и практики.

Тема 10. Плантационное лесовыращивание с использованием биотехнологии in vitro

Цель работы: уяснить цели создания плантационных лесных культур

10