2573

УДК 575

Колесникова, Е. О. Биотехнология растений. Адаптация этапов микроклонирования применительно к размножению кустарников [Текст]: методические указания к выполнению курсовой работы и дипломного проектирования для студентов по направлению подготовки 19.03.01Биотехнология, профиль – Промышленная экология / Е.О. Колесникова; ВГЛТУ. – Воронеж, ВГЛТУ, 2018. – ЭБС ВГЛТУ. – 16 с.

2

ВВ Е Д Е Н И Е

Методические указания предназначены для студентов дневного и заочного обучения, выполняющих курсовой проект или технологическую часть дипломного проекта по биотехнологии растений.

Методические указания содержат методику осуществления работы: характеристики объекта для биотехнологической работы; возможные варианты применения биотехнологических приѐмов для размножения кустарников; подбора элементов минерального питания, применяемых для культивирования; применения фитогормонов, используемых для активации ростовых процессов растительной культуры; микроклонирования применительно к кустарниковым культурам.

Приведены прописи составления питательных сред.

1 ХАРАКТЕРИСТИКА ОБЪЁКТА ДЛЯ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОЙ РАБОТЫ

Важным аспектом, обеспечивающим биотехнологическую и селекционную работу с любой культурой, является выявление биологического потенциала растений, выращиваемых в конкретном регионе.

1.1.Ботаническая характеристика растения

Таксономическая характеристика (семейство, род, вид), ареал обитания. Ботаническое описание растения. Биохимические особенности. Области возделывания.

1.2. Особенности роста и развития исследуемого растения в условиях открытого грунта

В результате проводимых исследований необходимо установить биоморфологические особенностей растения при выращивании в открытом грунте ЦЧР. Это касается высоты растения, типа стебля, характеристики побегов различного порядка, междоузлий. Необходимо отметить листорасположение, край листовой пластинки, форму листа, площадь листьев, изменение размеров метамеров.

Наблюдения за бутонизацией и цветением в период исследований. Необходимо отметить тип корневой системы.

Показать адаптационные свойства растения в зависимости от погодных условий, ГТК.

3

2 ВОЗМОЖНЫЕ ВАРИАНТЫ ПРИМЕНЕНИЯ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРИЁМОВ ДЛЯ РАЗМНОЖЕНИЯ КУСТАРНИКОВ

2.1. Зеленое черенкование

Понятие зеленого черенкования. Техника исполнения. Аспекты улучшения эффективности зеленого черенкования. Преимущества и недостатки.

2.2. Микроклональное размножение.

Понятие. Основные принципы. Типы питательных сред для различных кустарников. Преимущества и недостатки.

3 ЭЛЕМЕНТЫ МИНЕРАЛЬНОГО ПИТАНИЯ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

Основой всех питательных сред для культивирования растительных эксплантов является смесь минеральных солей. Это соединения азота в виде нитратов, нитритов, солей аммония; фосфора – в виде фосфатов; серы – в виде сульфатов; а также растворимые соли К+, Na+ , Са2+, Мg 2+ . Железо используется в виде хелатов (например, FeSO4·7H2O + этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) или еѐ натриевая соль Na ЭДТА (трилон Б)) – наиболее доступной форме для усвоения растительными тканями.

Прежде всего необходимо приготовить маточные растворы макро-, микросолей и витаминов. Для среды Мурасиге и Скуга обычно готовят маточные растворы следующего состава: 1) NH4NO3, KNO3, KH2PO4, MgSO4 .7H2O (MgSO4. 7H2O вливают последним без нагревания, что предотвращает выпадение осадка); 2) раствор CaCl2; 3) раствор хелата железа (раствор FeSO4и ЭДТАNa2, необходимый для образования хелата железа, следует нагреть до кипения); 4) раствор микроэлементов.

Полученные растворы сливают в склянки с притертой пробкой, снабжают этикеткой и хранят в холодильнике. Хелат железа хранят в темной склянке.

Концентрированные растворы витаминов (каждого в отдельности) хранят во флакончиках. Для приготовления растворов берут десятикратную по отношению к добавляемой дозе навеску витамина и растворяют в 10 мл воды. В 1 мл этого раствора содержится порция витамина, необходимая для приготовления 1 л раствора по прописи Мурасиге-Скуга.

4

3.1. Макроэлементы

Макроэлементы, их роль в развитии растений, в т.ч. кустарников. Основные макроэлементы, применяемые для микроклонирования кустарников, наведение их маточных растворов.

Компоненты питательной среды Мурасиге-Скуга:

Макросоли на 1 литр маточного раствора требуется растворить последовательно:

-КNO3 38 г.

-CaCl2 (безводный) 8,8 г.

или CaCl2 . 2H2O 13,8 г.

-NH4NO3 33 г.

-MgSO4 (безводный) 3,6 г.

или MgSO4 .7H2O 7,4 г.

- KH2PO4 3,4 г.

На 1 литр среды следует брать по 50,0 мл маточного раствора макросолей.

3.2. Микроэлементы

Микроэлементы, их роль в развитии растений, в т.ч. кустарников. Основные микроэлементы, применяемые для микроклонирования кустарников, наведение их маточных растворов.

Микросоли на 100 мл маточного раствора следует растворить последовательно:

-H3PO4 620 мг.

-MnSO4 . 4H2O 2230 мг.

-ZnSO4 860 мг.

-Kl 83 мг.

-Na2MoCl4 . 2H2O 25 мг.

-CuSO4 . 5H2O 2,5 мг.

-CoCl2 . 6H2O 2,5 мг

На 1 литр среды следует брать по 1,0 мл маточного раствора микросолей.

3.3.Хелат железа

Хелат железа и его роль в развитии растений, в т.ч. кустарников. Наведение маточного раствора.

5

Маточный раствор хелата железа готовят и хранят отдельно от других солей. Неправильное приготовление хелатного железа может привести к выпадению в осадок после автоклавирования фосфатов кальция и магния. Fe-хелат на 100 мл маточного раствора следует взвесить:

-FeSO4 .7H2O 557 мг.

-ЭДТА-Na2 (трилон Б) 745 мг.

На 1 л среды брать по 5 мл маточного раствора

4. ФИТОГОРМОНЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ АКТИВАЦИИ РОСТОВЫХ ПРОЦЕССОВ РАСТИТЕЛЬНОЙ КУЛЬТУРЫ

Фитогормоны и их роль в развитии растений. Основные гормоны и их действие.

Растворы фитогормонов готовят следующим образом.

Ауксины (2,4-Д, -НУК, ИУК, индолил-масляная кислота – ИМК): 100 мг вещества растворяют в 0,5-2 мл спирта, подогревают, добавляют дистиллированную воду до 100 мл (концентрация 1 мг/мл).

Цитокинины (кинетин, зеатин, БАП): растворяют в небольшом объеме 0,5 н. HCl, подогревают, добавляют соответствующий объем дистиллированной воды.

Абсцизовая кислота (АБК): навеску растворяют в 70%-ном этаноле, доводя до нужного объема.

Гиббереллиновая кислота (ГК): навеску растворяют в воде.

При введении фитогормонов в среду перед автоклавированием следует обязательно довести рН среды до 5,5-5,6. Однако следует учитывать, что после автоклавирования изменяется первоначальный состав термолабильных компонентов среды.

5. РЕАЛИЗАЦИЯ МЕТОДИКИ МИКРОКЛОНИРОВАНИЯ ПРИМЕНИТЕЛЬНО К КУСТАРНИКОВЫМ КУЛЬТУРАМ

5.1. Разработка схемы процесса микроклонирования

Эффективный метод микроклонального размножения растения, основанный на прямой регенерации побегов, должен включать: стерилизацию эксплантов хлорсодержащим агентом; использование питательной среды (например, МС, содержащей витамины и фитогормоны); длительное сохранение и укоренение растений.

6

5.2.Определение вариантов состава питательных сред и других условий культивирования

Компоненты питательной среды для выращивания растительных клеток и тканей можно разделить на 6 основных групп, что обычно отражает порядок приготовления концентрированных маточных растворов: макроэлементы, микроэлементы, источник железа, витамины, источник углерода, регуляторы роста.

Вкачестве источника углерода при выращивании гетеротрофных культур (каллусов и суспензий) в питательные среды добавляют углеводы в концентрации 20–60 г/л. Обычно это дисахариды (сахароза) либо моносахариды (глюкоза, фруктоза, ксилоза и др.). Полисахариды в питательных средах практически не используются. Только некоторые типы тканей (опухолевые), содержащие гидролитические ферменты, выращивают на средах с крахмалом или другими полисахаридами. Для стимуляции биохимических реакций в культивируемых клетках используют витамины группы В (В1, В6, В12), С (аскорбиновая кислота), РР (никотиновая кислота), мезоинозит.

Вкачестве цитокининов искусственные питательные среды могут содержать кинетин, бензиламинопурин (БАП), зеатин в концентрациях 0,001-10 мг/л. БАП и зеатин более активны по сравнению с кинетином в отношении поддержания роста изолированных тканей и индукции органогенеза. Кроме ауксинов

ицитокининов, отдельные питательные среды включают гибберелловую кислоту (ГК). Присутствие ГК в среде не является обязательным, но в некоторых случаях она стимулирует рост изолированной ткани.

Для культивирования растительных клеток и тканей in vitro применяют жидкие и агаризованные (твердые) среды. Агаризованные среды готовят на основе агар-агара – полисахарида, входящего в состав морских водорослей, который образует с водой гель при pH 5,6-6,0. Обычно к среде добавляют 0,7-0,8% агара. В качестве уплотнителя и заменителя агар-агара используют полиакриламидные гели (биогели). Разработано много питательных сред, но большинство из них преставляют модификации основных: Мурасиге-Скуга (МС), Уайта, ШенкаХильдебрандта, Гамборга (В5), Линсмайера-Скуга, Хеллера, Чапека и др. Для искусственных питательных сред растворы макро- и микросолей готовят заранее и используют многократно. Это маточные (концентрированные) растворы. Их хранят в специальных условиях: макро- и микросоли в холодильнике в сосудах с притертыми пробками при 0…+4оС. Витамины, фитогормоны, ферменты, растительные экстракты лучше хранить при –20оС в небольших по 5-10 мл сосудах с пробками. Маточные растворы макросолей

7

обычно превосходят рабочие по концентрации в 10-40 раз, микросолей – в 1001000 раз, витаминов – в 1000 раз.

В качестве эксплантов используют части стебля, листа. В состав сред вносят фитогормоны в различных комбинациях и концентрациях. Культивирование эксплантов проводят на свету при 16-ти часовом фотопериоде, при температуре 23-26 °С, освещѐнности 5 тыс. люкс и влажности воздуха 70 %. Опыт проводят в трѐхкратной повторности по 15 эксплантов на вариант.

5.3 Этапы микроклонирования исследуемого кустарникового расте-

ния

1–й этап – выбор растения донора, изолирование и стерилизация экспланта, создание условий для его роста на питательной среде in vitrо, получение хорошо растущей стерильной культуры;

2–й этап – собственно размножение, достижение получения максимального количества клонов;

3–й этап – укоренение размноженных побегов; 4–й этап – высадка растений–регенерантов в закрытый грунт с после-

дующей адаптацией к почвенным условиям; 5-й этап – доращивание растений в условиях теплицы и подготовка их к

высадке в лес, поле или к реализации.

На первом этапе необходимо добиться получения хорошо растущей стерильной культуры. В качестве эксплантов берут апикальные и пазушные почки, фрагменты стебля и листа. Стерилизацию осуществляют по схеме (табл. 1).

Таблица 1 – Схема опыта

В опытах применяют общепринятую технику стерилизации и приготовления питательных сред (Бутенко, 1999; Шевелуха, 2008).

При этом, как правило, используют среду, содержащую минеральные соли по прописи Мурасига и Скуга, Гамборга (Приложение 1) (либо по другим выбранным прописям), а также различные биологически активные вещества и

8

стимуляторы роста (ауксины, цитокинины) в различных сочетаниях в зависимости от объекта. Продолжительность первого этапа – от 1 до 2 месяцев.

На втором этапе важно достигнуть получения максимального количества мериклонов. Как и на первом этапе, используют питательную среду. Основную роль при подборе оптимальных условий культивирования эксплантов играют соотношение и концентрация внесенных в питательную среду цитокининов и ауксинов. Из цитокининов наиболее часто используют БАП в концентрациях от 0,1 до 10 мг/л, а из ауксинов – ИУК и НУК в концентрациях до 0,5 мг/л. При длительном культивировании растительных тканей в питательных средах с повышенным содержанием цитокининов (10 мг/л) происходит постепенное накопление их в тканях выше необходимого физиологического уровня, что приводит к формированию растений с измененной морфологией.

Третий этап является наиболее трудоемким, поскольку от него во многом зависит успех клонального микроразножения. На данном этапе, как правило, меняют основной состав среды. Уменьшают в два, а иногда и в четыре раза концентрацию минеральных солей в среде Мурасига и Скуга, снижают концентрацию сахара до 0,5–1 % и полностью исключают цитокинины, оставляя лишь ауксины. В качестве стимулятора корнеобразования используют ИМК, ИУК или НУК. Укоренение микропобегов проводят двумя способами:

-выдерживание микропобегов в течение 2–24 ч в стерильном концентрированном растворе ауксина (20–50 мг/л) с последующим их культивированием на агаризованной среде без гормонов или непосредственно в подходящем почвенном субстрате (импульсная обработка);

-культивирование микропобегов в течение 3–4 недель непосредственно на питательной среде, содержащей ауксин в невысоких концентрациях (1–5 мг/л).

В последнее время предложен пока еще мало практикуемый метод укоренения пробирочных растений в условиях гидропоники. Этот метод позволяет значительно упростить этап укоренения и одновременно получать растения, адаптированные к естественным условиям.

Пересадка растений-регенерантов в субстрат является ответственным этапом, завершающим процесс клонального микроразмножения. Наиболее благоприятное время для пересадки пробирочных растений – весна или начало лета. Растения с двумя–тремя листьями и хорошо развитой корневой системой осторожно вынимают из колб или пробирок пинцетом с длинными концами или специальным крючком. Корни отмывают от остатков агара и высаживают в почвенный субстрат, предварительно простерилизованный при 85–90 °С в те-

9

чение 1–2 ч. Горшочки с растениями помещают в теплицы с регулируемым температурным режимом (20–22 °С), освещенностью не более 5 тыс. лк и влажностью 65–90 %. Для лучшего роста растений создают условия искусственного тумана. В тех случаях, когда нет возможности создать такие условия, горшочки с растениями накрывают стеклянными банками или полиэтиленовыми пакетами, которые постепенно открывают до полной адаптации растений.

Процесс адаптации пробирочных растений к почвенным условиям является наиболее дорогостоящей и трудоемкой операцией. Нередко после пересадки растений в почву наблюдается остановка в росте, опадение листьев и их гибель. Это связано, в первую очередь, с тем, что у пробирочных растений нарушена деятельность устьичного аппарата, вследствие чего происходит потеря большого количества воды. Во–вторых, у некоторых растений в условиях in vitro не происходит образования корневых волосков, что приводит, в свою очередь, к нарушению поглощения воды и минеральных солей из почвы.

При разработке методов клонального микроразмножения растений необходимо учитывать влияние генетических, физиологических, гормональных и физических факторов. Это связано с тем, что методика, разработанная для определенного клона одного вида не всегда может быть применена для размножения других представителей этого вида и тем более растений другого вида.

Экспериментально доказано, что древесные растения и однодольные травянистые обладают меньшим морфогенетическим потенциалом, т. е. имеют менее выраженную способность к индукции заложения адвентивных почек, росту побегов, укоренению и, в конечном итоге, получению высокого коэффициента размножения, чем двудольные травянистые растения.

В результате работы делаются выводы по каждому пункту исследований.

10