Вопрос 17

История открытия нуклеиновых кислот: Открытие нуклеиновых кислот связано с именем молодого врача из города Базеля (Швейцария) Фридриха Мишера. После окончания медицинского факультета Мишер был послан для усовершенствования и работы над диссертацией в Тюбинген (Германия) в физиолого-химическую лабораторию, возглавляемую Ф. Гоппе-Зейлером. Пройдя практику по органической химии, Мишер приступил к работе в биохимической лаборатории. Ему было поручено заняться изучением химического состава гноя. Путём многочисленных опытов он получил из гнойных клеток вещество ядерного происхождения. Мишер был уверен именно в ядерном его источнике. Поэтому он начал более тщательное выделение ядер. Раньше этого никто не делал. Продолжив дальше очищать ядро от других клеточных фрагментов, он получил странное вещетво. Оно не разлагалось протеолитическими ферментами, значит, не являлось белком. Отсутствие растворимости в горячем спирте указывало на то, что это вещество не являлось и фосфолипидом. По-видимому, оно относилось к новому классу биохимических соединений. В 1871 г. работа Мишера вместе с подтверждающими ее контрольными работами Гоппе-Зейлера и его ассистентов увидела свет. Существование нуклеина как специфического ядерного вещества стало научным фактом. Вскоре методика Мишера была применена для выделения нуклеина из различных тканей. Термин «нуклеиновые кислоты» был предложен в 1889: нуклеиновыми они были названы потому, что впервые были открыты в ядрах клеток, а кислотами — из-за наличия в их составе остатков фосфорной кислоты. В конце XIX в. немецкий биохимик Альбрехт Коссель (1853-1927) расшифровал химический состав нуклеиновой кислоты, показав, что она содержит фосфорную кислоту, углевод и азотистые основания (пурины и пиримидины).В 1909 г. в результате гидролиза нуклеиновых кислот были выделены входящие в их состав сахара: рибоза и дезоксирибоза. В 1936 г. советский ученый А. Н. Белозерский впервые обнаружил ДНК в клетках растений. Это открытие имело принципиальное значение — ДНК стали рассматривать как универсальный биологический материал. Та­ким об­ра­зом бы­ло ус­та­нов­ле­но, что нук­леи­но­вые ки­сло­ты со­дер­жат­ся в клет­ках всех жи­вых ор­га­низ­мов. Был про­ве­дён их хи­ми­че­ский ана­лиз и ус­та­нов­лен эле­мент­ный со­став нук­леи­но­вых ки­слот. Со­глас­но ис­сле­до­ва­ни­ям нук­леи­но­вые ки­сло­ты со­сто­ят из С, H, O, P (8–10%) и N (15–16%). Ф. Левен, Д. Гулланд с сотрудниками (в цикле исследований, проведённых 1900-1932 гг.) установили, что фосфорная кислота, углевод и азотистое основание соединены в блоки в виде мономеров – нуклеотидов, расположенных вдоль линейной молекулы нуклеиновой кислоты. Нуклеиновая кислота, выделенная из ядер клеток, в качестве углевода содержит D-дезоксирибозу. Поэтому она получила название дезоксирибонуклеиновой кислоты – ДНК. Наряду с ядерной была выделена цитоплазматическая нуклеиновая кислота, содержащая в качестве углевода D-рибозу; она получила название рибонуклеиновой кислоты – РНК.

Доказательство роли ДНК как хранителя генетической информации:

• 1928г. Опыты Фредерика Гриффита. Объекта Streptococcus pneumoniae, патогенные бктерии, вызывающие пневмонию. Использовал 2 штамма Streptococcus: – S-штамм, вирулентный (клетки окружены полисахаридной капсулой, являющейся фактором вирулентности) – R- штамм, невирулентный (полисахаридная капсула отсутствует) Осуществляли инфицирование мышей указанными штаммами для того, чтобы понять различия между капсульным и бескапсульным вариантами. Выявили,что: – Живые клетки S-штамма убивают мышей; – Живые клетки R-штамма не убивают мышей; – Убитые нагреванием клетки S-штамма не убивают мышей; – Смесь убитых нагреванием клеток S-штамма и живых клеток R-штамма убивают мышей. Ф. Гриффитс предположил, что убитые нагреванием вирулентные пневмококки S-типа, имеют некий фактор (он устойчив к температуре), который трансформирует невирулентные клетки R-типа в вирулентные, при этом они становятся слизистыми, покрытыми полисахаридной капсулой. Ф. Гриффитс предположил, что трансформирующим фактором является белок. Убитые нагреванием клетки S-типа Время Живые клетки R-типа Живые клетки S-типа Ф. Гриффитс назвал перенос информации между клетками трансформацией. • В 1944 году Освальд Эйвери, Колин Мак. Леод и Маклин Мак Карти поставили перед собой цель - установить природу «трансформирующего» фактора. • Вместо убитых нагреванием целых клеток они предварительно разрушили их, т. е. взяли экстракт этих клеток. Полученный экстракт поочередно подвергли действию гидролитических ферментов, которые специфически разрушают определенные классы макромолекул – полисахариды, белки, липиды, РНК и ДНК. И затем изучили, при деградации каких макромолекул фактора исчезает трансформирующая активность клеточного экстракта. В результате этого эксперимента была выявлена природа трансформирующего фактора. Вывод: трансформирующим фактором является ДНК.

• 1952г. Эксперимент Альфреда Херши и Марты Чейз. Как известно, фаг Т2 является вирусом, инфицирующим бактерию E. Coli (кишечную палочку). фаговые частицы абсорбируются на наружной поверхности клетки, их материал проникает внутрь и примерно через 20 минут бактерия лизируется, освобождая большое количество фаговых частиц - потомков. В 1952 году Альфред Херши и Марта Чейз инфицировали бактерии фагами Т2, которые были мечены радиоактивными соединениями: ДНК - с помощью 32P. Белковая часть фага - 35S. После инфекции бактерии фагами, с помощью центрифугирования удалось выделить две фракции: пустые белковые оболочки фага и бактерии, инфицированных фаговой ДНК. Оказалось, что 80% метки 35S осталась в пустых фаговых оболочках, а 70% метки 32P - в инфицированных бактериях. Фаги-потомки получили только около 1% исходного белка, меченного 35S, однако они же обнаружили около 30% метки 32P. Результаты этого эксперимента прямо показали, что ДНК родительских фагов проникает в бактерии и затем становиться составляющей развившихся новых фагов частиц.

• 1957г. Опыты Френкеля – Конрата. Френкель-Конрат работал с вирусом табачной мозаики (ВТМ). В этом вирусе содержится РНК, а не ДНК. Было известно, что разные штаммы вируса вызывают разную картину поражения листьев табака. После смены белковой оболочки "переодетые" вирусы вызывали картину поражения, характерную для того штамма, чья РНК была покрыта чужим белком. Следовательно, не только ДНК, но и РНК может служить носителем генетической информации.

Свойства ДНК:

Физико-химические свойства ДНК:

• Растворы нативной ДНК вязкие из-за большого отношения длины молекулы к ее

диаметру.

• Благодаря азотистым основаниям ДНК поглощает свет в ультрафиолетовой области

спектра с максимумом ~ 260 нм. Поглощение для нативной двуспиральной ДНК на 40-50%

меньше, чем поглощение смеси свободных нуклеотидов того же состава. Это явление -

гипохромнымный эффект, обусловлено стэкинг-взаимодействием. Любое отклонение от

двухспирального состояния сказывается в изменении величины этого эффекта.

• Денатурация (плавление) ДНК – изменение пространственного расположения

цепей ДНК без разрыва ковалентных связей, т. е. происходит расхождение цепей ДНК. Такая

ДНК называется денатурированной. Переход от нативной формы к расплетенной

беспорядочно скрученной денатурированной форме можно обнаружить по увеличению

поглощения ультрафиолетового света (гиперхромный эффект) или по уменьшению вязкости

раствора ДНК. Таким образом, за денатурацией ДНК можно наблюдать, оценивая ее

гиперхромность, по величине которой можно судить о нативности ДНК.

Денатурирующие агенты: высокая температура (выше 80˚С), радиация, ультрафиолетовое излучение, изменение pH и ионной силы раствора, тяжелые металлы.

Среднюю точку температурного диапазона, при котором происходит разделение цепей

ДНК, называют точкой плавления и обозначают Тпл. Для каждого вида ДНК характерна своя

точка плавления. Чем выше содержание в ДНК Г-Ц пар, тем выше точка плавления. Это

связано с тем, что пары Г-Ц более стабильны (содержат три водородных связи),

следовательно, на их диссоциацию требуется больше энергии, чем на разрушение А-Т пар

(две водородные связи).

Денатурация ДНК обратима. При определенных условиях две разделенные

комплементарные цепи могут восстановить двойную спираль. Это явление называется

ренатурацией (отжиг).

• Высокая реакционная способность. ДНК представляет собой сильную кислоту,

таким образом, может образовывать прочные комплексы с положительно заряженными

белками, ионами металлов.

Репликация (редупликация, ауторепродукция) ДНК

Репликация ДНК — процесс самоудвоения, главное свойство молекулы ДНК. Репликация относится к категории реакций матричного синтеза, идет с участием ферментов. Под действием ферментов молекула ДНК раскручивается, и около каждой цепи, выступающей в роли матрицы, по принципам комплементарности и антипараллельности достраивается новая цепь. Таким образом, в каждой дочерней ДНК одна цепь является материнской, а вторая — вновь синтезированной. Такой способ синтеза называется полуконсервативным.

«Строительным материалом» и источником энергии для репликации являются дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (АТФ, ТТФ, ГТФ, ЦТФ), содержащие три остатка фосфорной кислоты. При включении дезоксирибонуклеозидтрифосфатов в полинуклеотидную цепь два концевых остатка фосфорной кислоты отщепляются, и освободившаяся энергия используется на образование фосфодиэфирной связи между нуклеотидами.

В репликации участвуют следующие ферменты:

• геликазы («расплетают» ДНК);

• дестабилизирующие белки;

• ДНК-топоизомеразы (разрезают ДНК);

• ДНК-полимеразы (подбирают дезоксирибонуклеозидтрифосфаты и комплементарно присоединяют их к матричной цепи ДНК);

• РНК-праймазы (образуют РНК-затравки, праймеры);

• ДНК-лигазы (сшивают фрагменты ДНК).

С помощью геликаз в определенных участках ДНК расплетается, одноцепочечные участки ДНК связываются дестабилизирующими белками, образуется репликационная вилка. При расхождении 10 пар нуклеотидов (один виток спирали) молекула ДНК должна совершить полный оборот вокруг своей оси. Чтобы предотвратить это вращение ДНК-топоизомераза разрезает одну цепь ДНК, что дает ей возможность вращаться вокруг второй цепи.

ДНК-полимераза может присоединять нуклеотид только к 3'-углероду дезоксирибозы предыдущего нуклеотида, поэтому данный фермент способен передвигаться по матричной ДНК только в одном направлении: от 3'-конца к 5'-концу этой матричной ДНК. Так как в материнской ДНК цепи антипараллельны, то на ее разных цепях сборка дочерних полинуклеотидных цепей происходит по-разному и в противоположных направлениях. На цепи 3'–5' синтез дочерней полинуклеотидной цепи идет без перерывов; эта дочерняя цепь будет называться лидирующей. На цепи 5'–3' — прерывисто, фрагментами (фрагменты Оказаки), которые после завершения репликации ДНК-лигазами сшиваются в одну цепь; эта дочерняя цепь будет называться запаздывающей (отстающей).

Особенностью ДНК-полимеразы является то, что она может начинать свою работу только с «затравки» (праймера). Роль «затравок» выполняют короткие последовательности РНК, образуемые при участи фермента РНК-праймазы и спаренные с матричной ДНК. РНК-затравки после окончания сборки полинуклеотидных цепочек удаляются.

Репликация протекает сходно у прокариот и эукариот. Скорость синтеза ДНК у прокариот на порядок выше (1000 нуклеотидов в секунду), чем у эукариот (100 нуклеотидов в секунду). Репликация начинается одновременно в нескольких участках молекулы ДНК. Фрагмент ДНК от одной точки начала репликации до другой образует единицу репликации — репликон.

SSB - белки – это белки, которые связываются с одноцепочечной ДНК и удерживают матрицу. В результате образуется репликативная вилка, где и происходит синтез новых цепей ДНК.

Репликация происходит перед делением клетки. Благодаря этой способности ДНК осуществляется передача наследственной информации от материнской клетки дочерним.

Этапы процесса репликации ДНК

Сначала молекула ДНК «расшнуровывается» — цепи молекулы расплетаются и расходятся (каждая из двух цепей будет служить своеобразной матрицей, на которой будет синтезироваться новая цепь).

Фермент ДНК-полимераза «прикрепляет» новые нуклеотиды к матрице по принципу комплементарности (к аденину — тимин, к цитозину — гуанин, и наоборот).

Как только процесс заканчивается, новые дочерние (сестринские) молекулы расходятся и скручиваются в спирали.

направление синтеза

Синтез новой цепи начинается с 5’-конца, новые нуклеотиды присоединяются всегда к 3’-концевому нуклеотиду, к его свободной ОН-группе. При этом комплекс белков, синтезирующий ДНК, двигается вдоль матричной нити в направлении от 3' к 5', постепенно расплетая новые участки двойной спирали. Новые данные экспериментов показывают, что, скорее, наоборот, ДНК протягивается сквозь статичную «фабрику репликации» — совокупность осуществляющих репликацию белков. Так продолжается до полного завершения удвоения всей молекулы ДНК. 

Репарация («ремонт»)

Репарацией называется процесс устранения повреждений нуклеотидной последовательности ДНК. Осуществляется особыми ферментными системами клетки (ферменты репарации). В процессе восстановления структуры ДНК можно выделить следующие этапы: 1) ДНК-репарирующие нуклеазы распознают и удаляют поврежденный участок, в результате чего в цепи ДНК образуется брешь; 2) ДНК-полимераза заполняет эту брешь, копируя информацию со второй («хорошей») цепи; 3) ДНК-лигаза «сшивает» нуклеотиды, завершая репарацию.

Наиболее изучены три механизма репарации: 1) фоторепарация, 2) эксцизная, или дорепликативная, репарация, 3) пострепликативная репарация.

Изменения структуры ДНК происходят в клетке постоянно под действием реакционно-способных метаболитов, ультрафиолетового излучения, тяжелых металлов и их солей и др. Поэтому дефекты систем репарации повышают скорость мутационных процессов, являются причиной наследственных заболеваний (пигментная ксеродерма, прогерия и др.).