Приложение г (обязательное) Некоторые методики изучения активности микроорганизмов
Как альтернатива использования химических средств защиты и стимуляции роста растений развиваются представления о возможностях регуляции внутрибиоценотических взаимоотношений между отдельными компонентами агросистем. Существенную роль в естественной защите растений от разнообразных патогенов, питании и стимуляции роста играет эндофитная, эпифитная и ризосферная микрофлора. Это обстоятельство послужило основой разработки и применения разнообразных бактериальных и грибных препаратов. Эффективность применяемых бактериальных препаратов, а также активность естественной эпифитной микрофлоры в значительной мере определяется спектром веществ, секретируемых растением.
Пониженный иммунитет растений может быть связан с низкой активностью микрофлоры, обусловленной недостатком или отсутствием продуцируемых растением отдельных регуляторных метаболитов. В ряду таких сигнальных веществ особое значение отводят фенолам, в частности, флавоноидам, которые могут выступать как стимуляторы, так и ингибиторы симбиоза, определяя спектр взаимодействующих с растением микроорганизмов и их метаболизм. В сельскохозяйственной практике используется ряд содержащих флавоноиды препаратов, полученных на основе экстракции растительного сырья органическими растворителями. Подобные препараты повышают урожайность и иммунитет сельскохозяйственных растений.
Для традиционной экстракционной технологии характерны ряд недостатков: использование токсичных и пожароопасных органических экстрагентов (ввиду малой растворимости в воде действующих веществ), невысокая степень извлечения за цикл, загрязнение среды отходами производства. В качестве альтернативы предлагается использование водной экстракции растительного сырья, которое с целью повышения эффективности экстракции подвергнуто предварительной механохимической обработке.
Роль механохимической обработки состоит в снижении диффузионных ограничений экстракции через увеличение поверхности раздела фаз, разрушении клеточных оболочек, включении в состав смеси микрочастиц реагентов вступающих в реакции с целевыми и балластными веществами, что увеличивает выход целевых веществ. Экстрагируемость водой и стабильность концентрированных растворов малорастворимых в воде флавоноидов обеспечивается присутствием в экстрагируемом сырье (древесина лиственницы) значительных количеств полисахарида арабиногалактана, обладающего диспергирующими и дефлокулирующими свойствами и традиционно используемого для стабилизации эмульсий.
Методика изучения влияния биопрепаратов на микрофлору пшеницы
При изучении влияния препаратов на рост патогенного гриба Fusarium oxysporum Schiecht. - факультативного возбудителя корневых фузариозных гнилей и трахеомикозного увядания растений, используют стандартную процедуру, применяемую для оценки фунгитоксичной активности веществ. Препараты в концентрации 0,01% сухого вещества включали в состав стерильной агаризованной среды Чапека, в центр которой помещали цилиндрическую высечку, из агаризованной среды Чапека с 5-и суточным газоном мицелия гриба. Через 7 суток инкубации по диаметру разросшегося мицелия характеризовали рост мицелия гриба. По каждому варианту делали не менее 3-х повторов. Процент ингибирования роста определяли по формуле: % ингибирования = (100 x [диаметр контроля - диаметр опыта]) /(диаметр контроля - диаметр высечки).
Методика изучения влияния биопрепаратов на рост бактерий Pseudomonas fluorescens в культуре.
Изучали бактерии Pseudomonas fluorescens, часто используемых в составе препаратов для сельского хозяйства. Ps. fluorescens культивировали в жидкой, полусинтетической пептонно-глюкозной среде, содержащей исследуемые препараты. Состав среды: (0,05М K,Na -фосфатный буфер рН 7,2; 0,02М (NH4)2SO4; 0,01M MgSO4; 0,5% - глюкоза; 1% ферментативный лактальбуминовый пептон. К 100 мл среды добавляли по 100 мкл бактериальной суспензии, содержащей 5х109 бактериальных клеток/мл.
Инкубацию проводили в колбах Элмеера (1 л) на качалке при 30ºС. Инкубацию останавливали через различные сроки после начала роста культуры. По завершении инкубации проводили измерения концентрации микроорганизмов в разведениях полученной суспензии по оптической плотности на 629 нм, из расчета 1х108 клеток/мл = 0,1 оптической единицы в диапазоне 0,15-0,4. Такой метод определения концентрации клеток ранее описан специально для бактерий Pseudomonas. В предварительных экспериментах было подтверждено хорошее соответствие величин концентрации бактерий рассчитанных по оптической плотности суспензии и определенных методом высева разведений суспензии бактерий на твердую питательную среду (пептонно-глюкозная среда, содержащая 2% агара).
Методика получения реизолятов исходных культур ризосферных бактерий
Чтобы добиться стабильного результата при выращивании бактериальной культуры с заданными свойствами, необходимо контролировать качество продукции на каждом этапе производства. Часто штаммы микроорганизмов, хранящиеся в чистой музейной культуре на искусственных средах, теряют свои изначальные свойства как продуценты активных веществ, либо азотфиксирующую и фосфатмобилизующую активность.
Поэтому перед производственным сезоном необходимо восстанавливать свойства штаммов, пропуская микроорганизмы через естественную их среду обитания, проводя их через корни растений в стерильных условиях по следующей методике. Стерилизованные семена помещали в пробирки со стерильной почвой, инокулировали изучаемой бактериальной культурой. Стерильные семена пшеницы получали путем двухэтапной стерилизации 0,1% раствор HgCl2 в течение 20 минут смесью 96% C2 H2 OH и 30% H2O2 в течение 2 минут с последующим отмыванием стерильной водой.
Стерильность семян проверяли, помещая обработанные семена на картофельный агар и МПА. Почву стерилизовали три раза с суточными перерывами в сухо- жаровом шкафу при плюс 160 оС по 2 часа. Предварительно обработанные семена проращивали в чашках Петри на фильтровальной бумаге, смоченной стерильной дистиллированной водой. Через 7 суток после посева проростков у выросшего растения отделяли корни и гомогенизировали в ступке в стерильных условиях. Гомогенизат помещали в 30 мл флакон, добавляли 5 мл среды Эшби и получали накопительную культуру.
Из полученной культуры делали истощающий посев для получения отдельных колоний. Каплю биомассы, с накопительной культурой из корней микробиологической петлей помещали на первую чашку Петри. Растирая каплю в первой чашке Петри шпателем, и, не обжигая его в пламени спиртовки, последовательно проводили посев в следующих шести чашках для получения отдельных бактериальных колоний. Отдельные операции методик показаны на фотографиях – рисунки Г1 – Г 2.
Рисунок Г1 - Отбор колоний бактерий с ярко выраженной фосфатмобилизующей активностью по зонам осветления агаризованной среды со свежеосажденным Сa3(PO4)2.
Рисунок Г2 - Введение в чистую культуру микроорганизмов
Полученные таким образом реизоляты микроскопировали и проверяли на заданные свойства (накопление биомассы, фунгистатическая и ростостимулирующая активность, способность колонизировать ризосферу, фосфатмобилизация).