8.1 Преинфекционные (сигнальные) взаимодействия

Развитие бобово-ризобиального симбиоза - сложный многостадийный процесс, который включает четыре группы процессов:

- ранние (преинфекционные) взаимодействия;

- морфогенез клубеньков;

- регуляция развития эндосимбионтов;

- функционирование клубеньков, как органов азотфиксации.

Все эти процессы находятся под контролем взаимодействующих организмов – растения-хозяина и микроорганизмов. Обмен партнеров молекулярными сигналами происходит при любых симбиотических взаимодействиях. На ранних этапах симбиоза это обеспечивает переход организмов из свободноживущего в симбиотическое состояние, на более поздних – метаболические и морфогенетические процессы, обеспечивающие функционирование симбиоза. Сигналы часто действуют на уровне транскрипции и трансляции генов-мишеней.

Образование симбиоза клубеньковых бактерий начинается с реакции ризобий на растительные флавоноиды, которые активируют бактериальные гены вирулентности nod (от англ. nodulation – клубенькообразование). На рисунке 47 показана структура nod- факторов ризобий, показаны наиболее важные заместители – ацильная группа на нередуцирующем конце (С18:1 или С18:4) и варианты заместителей в позиции R5 на редуцирующем конце.

Рисунок 47 - Структура nod-факторов ризобий (по В.С. Шевелуха с соавт.)

Под контролем этих генов ризобии синтезируют липо-хито-олигосахаридные nod-факторы, которые инициируют ранние стадии развития клубеньков. К настоящему времени известно более 50 генов вирулентности у ризобий. Некоторые из этих генов одинаковы, как структурно, так и функционально, для разных ризобий, другие специфичны для каждого вида или даже штамма.

Мутации в одинаковых nod-генах (nodА, nodВ, nodС) приводят к нарушению самой ранней стадии развития симбиоза – скручивания корневых волосков. При мутациях генов хозяйской специфичности (nodH, nodP, nodQ, nodZ, nodX) обычно нарушаются более поздние стадии взаимодействия, связанные с формированием инфекционных нитей и клубеньковых меристем. Важные различия между этими группами генов вирулентности выявляются и при переносе их между разными видами ризобий.

Перенос генов хозяйской специфичности обычно приводит к тому, что штамм-реципиент приобретает способность формировать клубеньки у растений–хозяев штамма-донора. При переносе одинаковых, неспецифичных nod-генов такого эффекта не наблюдается, однако, если реципиентом является вирулентный мутант с нарушением собственных nod-генов, одинаковых для разных видов, то у него наблюдается восстановление способности формировать клубеньки на исходных растениях-хозяевах.

Гены обеих групп являются индуцибельными: их активность первоначально удавалось зарегистрировать только после попадания ризобий в ризосферу растения. При этом флавоноиды, выделяемые в почву семенами или корнями бобовых, взаимодействуют с бактериальным белком NodD, который в результате приобретает способность активировать транскрипцию остальных nod-генов (nodD – единственный конститутивно работающий ген вирулентности ризобий).

Белок NodD связан с внутренней мембраной ризобиальной клетки, через которую проникают флавоноиды. Взаимодействуя с ним, белок NodD изменяет свою конформацию, в результате чего становится возможным его связывание с консервативной последовательностью «nod-box», расположенной в промоторах индуцибельных генов вирулентности. В результате повышается сродство этих промоторов к РНК-полимеразе и индуцируется их транскрипция. Схема обмена сигнальными молекулами между горохом и бактерией Rhizobium leguminosarum приведена на рисунке 48.

Рисунок 48 - Схема обмена сигнальными молекулами между горохом и бактерией Rhizobium leguminosarum (по В.С. Шевелуха с соавт)

Как показано на рисунке, корни растений выделяют специфические флавоноиды, которые в комплексе с бактериальным белком NodD активизируют синтез бактериальных сигнальных молекул - Nod-факторов. Их биосинтез кодируется nod-генами, расположенными на Sym-плазмиде.

Конечным продуктом действия генов вирулентности являются Nod-факторы, способность к синтезу которых – уникальное свойство ризобий. Эти факторы представляют собой модифицированные синтезируют липо-хито-олигосахариды, которые состоят из 3-6 остатков N-ацетилглюкозамина и радикала ненасыщенной жирной кислоты, содержащего 16-20 атомов углерода – рисунок 47.

Биосинтез этих факторов включает процессы:

- полимеризация N-ацетилглюкозамина (синтезируемых из фукозы под контролем белка NodМ) с образованием 1—4-β-гликозидных связей. Эта реакция, катализируемая белком NodС, приводит к образованию олигомеров хитина;

- деацетилирование «нередуцирующего» концевого остатка глюкозамина в положении R1 (катализируется белком NodВ) и последующее присоединение к атому азота жирнокислотного остатка (катализируется белком NodА);

- модификация образовавшегося липо-хито-олигосахарида (коровая часть Nod-фактора): атомы водорода на «редуцирующем» и «нередуцирующем» концах замещаются на различные радикалы (фукозил, сульфат, метил, ацетил и др.) – рисунок 49.

GlcNac - N-ацетилглюкозамин; GDP-Fucose - гуанозиндифосфо- фукоза; Acetyl Coa - ацетил-кофермент; PAPC 3¹-фосфоаденозин-5¹-фосфосульфат; SAM – S-аденозил-метионин.

Рисунок 49 - Биосинтез Nod-факторов (по В.С. Шевелуха с соавт.)

Приведенные стадии биосинтеза Nod-факторов контролируются разными группами nod-генов: синтез коровой части происходит под контролем «общих» nod-генов, а его модификация – под контролем генов хозяйственной специфичности. Очищенные Nod-факторы в концентрации всего 10^-8- 10^-12 М инициируют ранние стадии формирования симбиоза, скручивание корневых волосков, закладку клубеньковых меристем, а у некоторых бобовых, даже начальные стадии гистогенеза клубеньков. Отмечено, что Nod-факторы – это те сигналы, которые в значительной степени определяют специфичность всего процесса симбиотического взаимодействия. Наибольшую роль в этом играют модификации Nod-факторов, осуществляемые под под контролем генов хозяйственной специфичности.

Синтез и фенотипические эффекты Nod-факторов достаточно изучены, так как выделяются бактериями в среду, и их действие может быть легко промоделировано в системах in vitro. В меньшей степени изучены процессы рецепции бактериального сигнала и его последующей передачи в растении. В настоящее время показано, что перенос генов, контролирующих синтез некоторых фракций корневых лектинов, между разными бобовыми может сопровождаться расширением симбиотической специфичности. Выявлены фракции корневых лектинов бобовых, которые специфически связываются с Nod-факторами in vitro и при этом важны для образования симбиоза (обработка корней антителами, полученными на данные лектины, блокируют образование клубеньков). По-видимому, растительные лектины являются по меньшей мере одним из компонентов системы рецепции Nod-факторов.