Огурцов А. Н. Методы бииоинформационного анализа

Алгоритм глобального выравнивания двух биологических последовательностей методом динамического программирования был впервые предложен C.Б. Нидлманом и К.Д. Вуншем (S.B. Needleman & C.D. Wunsch). Для идентификации локального совпадения подобный алгоритм был впервые использован Т. Смитом и М. Уотерманом (T. Smith & M. Waterman).

3.2. АЛГОРИТМ ГЛОБАЛЬНОГО ВЫРАВНИВАНИЯ

Алгоритм глобального выравнивания Нидлмена-Вунша методом динамического программирования заключается в построении на данном этапе оптимального выравнивания, используя полученные на предыдущих этапах оптимальные выравнивания начальных фрагментов исходных последовательностей.

Для двух выравниваемых последовательностей x и y с элементами xi (0 <i < n ) и y j (0 < j < m ) мы строим матрицу F . Элемент F(i, j) этой матрицы содержит вес (счёт, score) наилучшего выравнивания начальных фрагментов x1…i (длиной i ) и y1…j (длиной j ) последовательностей x и y , соответственно. Матрицу F мы строим рекурсивно. Начинаем с того, что присваиваем начальной точке нулевой вес F(0,0) =0 . Далее мы заполняем матрицу в порядке возрастания обоих индексов, то есть с верхнего левого угла к нижнему правому. Если уже известны

F(i −1, j −1) , F(i −1, j) и F(i, j −1) , то можно вычислить F(i, j) .

Возможны три варианта получения веса F(i, j) в соответствии с тремя возможными вариантами выравнивания, представленными на рисунке 16.

Элемент xi одной последовательности может быть выровнен с элементом y j второй последовательности (рисунок 16(а)), и тогда к значению веса F(i −1, j −1) добавляем очки за выравнивание s(xi , y j ) (например, из матрицы BLOSUM)

F(i, j) = F(i −1, j −1) + s(xi , y j ) .

62

а – элемент xi выровнен с y j ; б – элементу xi сопоставлен пропуск (gap); в – элементу y j сопоставлен пропуск

Если же элементу xi одной последовательности сопоставлен пропуск (gap) "–" во второй последовательности (рисунок 16(б)), то за это "начисляется" штраф d

F(i, j) = F(i −1, j) −d .

В случае, когда элементу y j сопоставлен пропуск в последовательности x (рисунок 16(в)), также "начисляется" штраф

F(i, j) = F(i, j −1) −d .

Наибольший вес выравнивания двух фрагментов последовательностей x1…i (длиной i ) и y1…j (длиной j ) определяется как максимум этих

трёх вариантов

F(i −1, j −1) + s(xi , y j ), F(i, j) = max F(i −1, j) −d,

F(i, j −1) −d.

Такую рекурсивную процедуру повторяем, последовательно увеличивая номер строки i (а внутри строки – последовательно увеличивая номер столбца j ), до тех пор, пока не будет заполнена вся матрица F(i, j) .

Рассмотрим "квадрат", состоящий из четырёх соседних ячеек матрицы (рисунок 17).

63

Рисунок 17 – Три варианта получения веса F(i, j)

Каждое последующее значение F(i, j) в правом нижнем углу каждого такого "квадрата" из четырёх ячеек определяется из одной из оставшихся трёх ячеек (показано стрелками на рисунке 17).

При заполнении матрицы F одновременно с вычислением значений F(i, j) необходимо запоминать, по какому из трёх "путей" (из какой клетки на рисунке 17) было получено это конкретное значение F(i, j) . Такое запоминание впоследствии, после заполнения всей матрицы, нужно для восстановления "маршрута" выборов.

Прежде чем закончить описание алгоритма необходимо определить граничные условия – процедуру заполнения ячеек верхней строки ( j =0) и левой колонки (i =0) .

Поскольку вдоль верхней строки, где ( j =0) , получение значений F(i,0) при движении слева направо (горизонтальная стрелка на рисунке 17) соответствует вставкам пропусков в последовательность y , то устанавливаем

F(i,0) = −d .

Аналогично вдоль левой колонки с (i =0)

F(0, j) = −d .

64

Значение правой нижней ячейки матрицы F(n,m) по определению является наилучшим весом выравнивания двух последовательностей x1…i и y1…j . Для построения самого выравнивания необходимо восстановить последовательность выборов, которая и привела от начальной точки (0,0) к финальной точке (n,m).

Процедура восстановления выборов называется процедурой обратного прохода (traceback procedure). Она осуществляется построением выравнивания с конца, от правой нижней ячейки матрицы с координатами (n,m) следуя тем указателям шагов, которые были получены при построении матрицы.

На рисунке 18 представлена таблица динамического программирования глобального выравнивания двух последовательностей

x= HEAGAWGHEE y = PAWHEAE,

рассчитанная на основе матрицы замен BLOSUM50 и значения величины штрафа d =8 .

Рисунок 18 – Глобальное выравнивание методом Нидлмена-Вунша

65

Стрелками на рисунке 18 показаны указатели для процедуры обратного прохода. Значения, соответствующие оптимальному выравниванию выделены жирным шрифтом. Оптимальное выравнивание этих двух последовательностей с весом 1, построенное с помощью процедуры обратного прохода имеет вид

x : HEAGAWGHE-E y : --P-AW-HEAE.

На каждом шаге процедуры обратного прохода мы движемся от текущей ячейки (i, j) "обратно" к одной из ячеек (i −1, j −1) , (i −1, j) , (i, j −1) из которых и было вычислено значение веса F(i, j) .

При этом мы добавляем слева к текущему выравниванию пару символов

•x−i – если вес был получен из ячейки (i −1, j)

(горизонтальная стрелка);

(вертикальная стрелка).

В конце выравнивания мы достигаем левого верхнего угла матрицы (0,0).

3.3. АЛГОРИТМ ЛОКАЛЬНОГО ВЫРАВНИВАНИЯ

Алгоритм Смита-Уотермана используют в случае, когда необходимо найти оптимальное выравнивание подпоследовательностей (subsequences) исходных последовательностей x и y , например, когда производится поиск общих доменов у белков.

66

Локальное выравнивание также является эффективным способом обнаружения сходства при сравнении сильно дивергировавших последовательностей.

Наилучшим локальным выравниванием называется выравнивание подпоследовательностей x и y с самым большим весом.

В целом алгоритм локального выравнивания подобен алгоритму глобального выравнивания, но в нём существуют два отличия.

Первое отличие – для получения значения веса для каждого элемента матрицы динамического программирования добавлена возмож-

ность присвоения нулевого веса F(i, j) =0 в случае, если все остальные варианты выбора дают отрицательные значения

0,

F(i, j) = max F(i −1, j −1) + s(xi , y j ),

F(i −1, j) −d,F(i, j −1) −d.

Если наилучшее выравнивание на данном этапе имеет отрицательный вес, то лучше начать новое выравнивание, чем продолжать старое. Всякий раз, когда наилучший вес в ячейке матрицы оказывается отрицательным, в ячейку записывается 0 и ставится метка, что отсюда дальше пути нет, и что начинается новое выравнивание.

Вследствие добавления нового "нулевого" выбора, элементы верхней строки и левого столбца в данном алгоритме также приравниваются нулю, а не −id и − jd , как при глобальном выравнивании.

В результате любая подпоследовательность может "скользить" вдоль другой перед началом выравнивания без прибавления штрафов за вставки пропусков (делеции) оставленные позади.

Второе отличие – выравнивание может закончится в любом месте таблицы, а не только в правом нижнем углу, как в случае глобального выравнивания. Таким образом, вместо F(n,m) наилучшим весом при

67

локальном выравнивании может быть наибольшее значение F(i, j) в матрице, и процедуру обратного прохода нужно начинать именно с этого места.

На рисунке 19 показан пример нахождения локального выравни-

вания

AWGHE

AW-HE

тех же последовательностей, для которых на рисунке 18 было найдено глобальное выравнивание. В данном случае локальное выравнивание оказалось подмножеством глобального выравнивания. Однако это не всегда так.

Рисунок 19 – Локальное выравнивание методом Смита-Уотермана

В настоящее время в программах осуществляющих поиск локальных совпадения используют модифицированные алгоритмы СмитаУотермана, в которых используются аффинные функции штрафов за разрывы.

68

3.4.ПРИБЛИЖЁННЫЕ МЕТОДЫ ДЛЯ БЫСТРОГО ПОИСКА

ВБАЗАХ ДАННЫХ

По общепринятой практике гены из нового генома сравниваются со всеми последовательностями из базы данных.

Сначала обычно используют приближённые методы, которые могут работать хорошо и быстро для поиска похожих последовательностей, однако при поиске очень отдалённых связей они могут работать хуже, чем точные методы.

На практике приближённые методы дают удовлетворительный результат во многих случаях, когда последовательность запроса достаточно похожа на одну или несколько последовательностей в базе данных, и поэтому имеет смысл пробовать их первыми.

Типичный приближённый подход выбирает некое малое целое значение k и находит все подстроки длиной k символов в последовательности запроса, которые появляется также в какой-либо последовательности в базе данных.

Такая короткая идентичная последовательность называется "слово" или "k-кортеж" ("k-tuple").

В математике кортежем называют последовательность конечного числа элементов. В некоторых языках программирования кортеж является особым типом структуры данных. В языке Python кортеж (англ. tuple) отличается от списка тем, что кортеж нельзя изменять.

Само слово "tuple" – это своеобразный обобщающий "суффикс" в

перечислении слов всё большей длины: single, double, triple, quadruple, quintuple, sextuple, septuple, octuple, ..., n-tuple, ...

Последовательность-кандидат – это последовательность в базе данных, содержащая большое число подходящих k-кортежей.

Затем для отобранного набора последовательностей-кандидатов производятся вычисления приближённого оптимального выравнивания с временным и пространственным ограничением, которое предусматривали проходы по матрице в пределах диагоналей, содержащих многочисленные совпадающие наборы k-кортежей.

69

Методы слов, или k-кортежей, которые реализованы в алгоритмах таких программ, как FASTA и BLAST, являются достаточно быстрыми и позволяют просматривать полную базу данных при поиске последовательности-кандидата, которая даёт наилучшее выравнивание с последовательностью запроса.

Алгоритмы программ FASTA и BLAST являются эвристическими, то есть основанными на эмпирических методах машинного программирования, в которых решение находится по установленным опытным путём правилам и используется обратная связь для уточнения результата.

Основная операция при поиске в базе данных – выравнивание последовательности запроса с каждой последовательностью-кандидатом базы данных; и если эвристические методы позволяют выполнить эту операцию значительно быстрее, то лучше применять именно их, а не алгоритмические методы динамического программирования.

Программа FASTA обеспечивает как высокий уровень чувствительности, так и большую скорость поиска подобия. Чувствительность достигается за счёт реализованных в программе FASTA алгоритмов оптимизированного локального выравнивания и анализа матрицы замен.

Сначала FASTA подготавливает список слов-кортежей, выбранных из пары сравниваемых последовательностей. Слово представляет собой строку из 3-6 нуклеотидов или 1-2 аминокислот. При этом слова-кортежи не должны перекрываться. Затем программа сопоставляет слова-кортежи и ведёт подсчет совпадений.

Подобно построению диаграммы и вычислению счёта точечной матрицы, FASTA отбирает варианты с максимальным числом слов на диагонали, находит совпадение с возможно высоким счётом и помечает результат (совпадение слов) как элемент № 1. Если максимальный счёт оказывается достаточно большим, программа переходит ко второму уровню.

На втором уровне для каждого лучшего совпадения слов производится поиск соседних приблизительных совпадений, и если значение счёта удовлетворительно, то программа объединяет короткие

70

сегменты элемента № 1, строит из них более длинную диагональ точечной матрицы и вычисляет счёт после включения пропуска и оценки штрафа.

Наилучший счёт из счетов второго уровня называют начальным числом. FASTA сохраняет счета начальных чисел, вычисленные для всех сравнений последовательности запроса с предметной последовательностью. После того как все последовательности базы данных проверены, те последовательности, которые дают максимальные счета начальных чисел, используются для построения (с помощью алгоритма СмитаУотермена) локального выравнивания с возможно большим оптимальным счётом.

Файл данных в формате FASTA включает в себя строку-титр (заголовок) и строки данных о последовательности. Описание последовательности следует за строкой-титром, в начале которой стоит знак «>». Первое слово в этой строке – название последовательности, далее идёт описание последовательности. Остальные строки содержат саму последовательность. При чтении файла данных программа FASTA игнорирует пустые строки, а также все знаки пробелов или пропусков в последовательности. Файл, объединяющий в себе множество последовательностей, построен по тому же принципу – строки, содержащие описание последовательностей, идут друг за другом.

Формат FASTA принят во многих программах множественного выравнивания последовательностей.

3.5. ЗНАЧИМОСТЬ ВЫРАВНИВАНИЙ

Для оценки биологической значимости выравнивания данной последовательности с другими последовательностями из баз данных принято сравнивать полученные результаты с результатами выравнивания данной последовательности с последовательностями, полученными с помощью статистически случайных перестановок элементов в последовательностях из баз данных.

Очевидно, что если рандомизированные последовательности дают такой же результат, как и исходные, то, скорее всего, выравнивание не имеет биологического смысла.

71

E-value. Программы поиска по базам данных, в том числе и PSIBLAST, указывают E-value.

E-value выравнивания – это ожидаемое количество последовательностей, которые бы имели Z-score такой же (или лучше), как если бы мы в качестве запроса дали программе случайную последовательность.

Ориентировочно значения E-value можно интерпретировать следующим образом:

Е< 0,02 вероятно, последовательности являются гомологами; 0,02 < E < 1 гомология не очевидна;

Е> 1 следует ожидать, что это случайное совпадение.

Следует отметить, что статистические оценки полезны и необходимы, но они не могут заменить здравый смысл и тщательный и аккуратный анализ биологичности результатов.

Существует множество эмпирических правил интерпретации процента идентичных аминокислотных остатков в оптимальном выравнивании белковых последовательностей.

Если два белка содержат более 45% идентичных остатков в их оптимальном выравнивании, то есть все основания предполагать, что эти белки имеют подобные структуры и, скорее всего, общую или, по крайней мере, сходную функцию.

Если они содержат более 25% идентичных остатков, они, вероятно, имеют подобный фолдинг.

С другой стороны, низкая степень сходства последовательностей не может исключить возможность гомологии.

Р.Ф. Дулитл определил область 18-25% сходства последователь-

ностей как область двусмысленности (или, область неоднозначности),

для которой предположение о гомологии можно высказывать только в

73

качестве гипотезы. Парные выравнивания, которые находятся ниже этой области, малоинформативны.

При этом отсутствие значимого сходства последовательностей совсем не означает отсутствие сходства структур.

Хотя область неоднозначности и ненадежна для выводов, но для решения вопроса об истинном родстве важна также "текстура" (профили) выравнивания – изолированы ли эти сходные остатки и распределены по всей последовательности или же они образуют "айсберги" – локальные участки высокого сходства (ещё один термин Дулитла), которые могут соответствовать общему активному центру. Также полезно использовать дополнительную информацию об общих лигандах или функциях. В случае, если пространственные структуры известны, то мы можем проверить их сходство непосредственно.

Эмпирические правила являются скорее рекомендациями, чем закономерностями. Приведём несколько характерных примеров.

Миоглобин кашалота и леггемоглобин люпина имеют 15% иден-

тичных остатков в оптимальном выравнивании. Это даже ниже определенной Дулитлом области неоднозначности. Однако известно, что обе молекулы имеют сходные трехмерные структуры, содержат гемовые простетические группы и связывают кислород. Они действительно являются удаленными гомологами.

Последовательности N- и С-концевых частей в одном и том же белке роданез имеют 11% идентичных остатков в оптимальном выравнивании. Если бы они возникли в разных белках, нельзя было бы судить об их родстве, исходя лишь из последовательностей. Однако такая ситуация в одном белке дает основание полагать, что они произошли путём дупликации и дивергенции генов. Очевидное сходство их структур подтверждает их родство.

Две протеазы химотрипсин и субтилизин имеют последовательности схожие на 12%. Эти сериновые протеазы выполняют сходную функцию и их активный центр образован тремя характерными для них остатками. Тем не менее, они имеют разную пространственную укладку и не родственны (рисунок 20).

74

Рисунок 20 – Схема строения сериновых протеаз: а – типа трипсина; б – типа субтилизина. Схематически изображены α-спирали, β-листы и β-цилиндры. Район активного центра показан треугольником

Схожесть их каталитических функций – это пример конвергентной эволюции. Поэтому не стоит предполагать родственную связь между белками с непохожими последовательностями, основываясь только на схожести их функций.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1.Каковы недостатки метода динамического программирования?

2.За счёт чего сокращается время расчётов в методе динамического программирования?

3.Чем отличаются методы Нидлмена-Вунша и Смита-Уотермана?

4.Каков алгоритм заполнения ячеек F(i, j) матрицы динамического программирования?

5.Какие существуют два отличия алгоритма локального выравнивания от алгоритма глобального выравнивания?

6.Что такое k-кортеж?

7.Какие три статистических параметра используют для оценки значимости выравнивания?

75

4. МНОЖЕСТВЕННОЕ ВЫРАВНИВАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Множественным называют выравнивание двух и более последовательностей. Групповой анализ последовательностей, входящих в семейства генов, предполагает установление связей между более чем двумя членами группы, что позволяет выявить скрытые консервативные характеристики семейства.

Цель множественного выравнивания последовательностей состоит в том, чтобы произвести краткую, но исчерпывающую характеристику данных о структуре последовательностей, на основании которой можно будет принять решение о принадлежности этих последовательностей к рассматриваемому семейству генов. По сравнению с попарным, множественное выравнивание даёт больше информации об эволюционной консервативности. Для того чтобы множественное выравнивание было максимально информативным, оно должно содержать равномерную выборку близко и отдалённо связанных последовательностей.

Для построения оптимального множественного выравнивания последовательностей в соответствующие столбцы сводят как можно больше подобных знаков. Множественное выравнивание группы последовательностей может обеспечить информацию о наиболее подобных областях, присущих этой группе. В белках такие области могут быть представлены консервативными доменами – функционально активными или структурными.

Если известна структура одного или нескольких членов выравнивания, то иногда возможно предсказать, какие аминокислоты образуют подобные пространственные структуры в других белках-членах выравнивания или какие гены занимают те же участки в последовательностях других нуклеиновых кислот-членов выравнивания. Множественное выравнивание последовательностей применяют также для

(1)предсказания зондов, специфичных к другим членам группы, или для

(2)открытия семейства подобных последовательностей – из одного или разных организмов.

76

4.1. ВИЗУАЛИЗАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ВЫРАВНИВАНИЯ

Для облегчения анализа результатов множественного выравнивания белков аминокислотные остатки разных типов окрашивают на экране компьютера разными цветами. Один из возможных способов окраски представлен в таблице 10.

Таблица 10 – Один из возможных способов окраски аминокислотных остатков при визуализации множественного выравнивания белковых последовательностей

Пример использования цветовой палитры (насколько это возможно в чёрно-белом представлении) представлен на рисунке 21.

Рисунок 21 – Представление множественного выравнивания белковых последовательностей

77

Важным элементом визуализации результатов множественного выравнивания являются аннотации или консенсусы.

Простейший вид аннотации использует программа ClustalW, в которой степень консервативности физико-химических свойств аминокислот в данной позиции выравнивания (в данном столбце) обозначается символами: "*" – "идентичность", ":" – "консервативность" и "." – "полуконсервативность" замен аминокислот в пределах данного столбца (рисунок 22).

Рисунок 22 – Результат множественного выравнивания аминокислотных последовательностей панкреатических эндонуклеаз лошади, малого полосатика и большого рыжего кенгуру

Более информативным способом визуализации результатов множественного выравнивания является генерация компьютером консенсусной строки, в которой изображаются те аминокислоты, которые наиболее часто встречаются в соответствующих столбцах данного выравнивания. Пример такого консенсуса – нижняя строка ("Consensus") на рисунке 21.

Для того, чтобы отобразить величину консервативности консенсусную строку изображают в виде гистограммы ("профиля") (рисунок 23(а)), в которой часто подписывают наиболее вероятные аминокислоты, причём размер символа соответствующей аминокислоты пропорционален частоте появления данной аминокислоты в данном столбце множественного выравнивания (рисунок 23(б, в)).

78

Рисунок 23 – Примеры аннотаций: а – гистограмма консервативности; б – консенсусная строка с символами аминокислот; в – формат представления Logo

Чтобы множественное выравнивание было информативным, оно должно содержать разные по эволюционному расстоянию последовательности.

Если все последовательности (1) чересчур близкие, то информация, которую они несут, избыточно дублируется, и это выравнивание малоинформативно.

А если все последовательности (2) далеки друг от друга, то трудно будет построить аккуратное выравнивание (кроме тех белков, для которых известны структуры), и в таком случае достоверность результатов и сделанных на их основе выводов оказывается под вопросом.

В идеале множественное выравнивание должно содержать широкий набор (спектр) белков разного уровня сходства, включающий далеко отстоящие экземпляры среди множества близких гомологов.

79