Этап 2. Определение концентрации клеток в суспензии дрожжей

Для подсчета клеток различных микроорганизмов, в том числе и дрожжей, используют счетную камеру Горяева (рис. 2), которая состоит из толстого покровного шлифованного стекла и толстой шлифованной стеклянной пластинки с углублением в центре, на дне которого нанесены две одинаковые сетки.

Сетка разбита на 225 больших квадратов (15 рядов по 15 квадратов), каждый из которых состоит из 16 маленьких (4 ряда по 4 квадратика).

Для получения точных и воспроизводимых результатов перед внесением препарата покровное стекло необходимо тщательно притереть к стеклянной пластинке осторожными движениями больших пальцев до появления радужных колец (кольца Ньютона) по краям покровного стекла.

Под притертое покровное стекло микробиологической петлей или стеклянной палочкой вносят каплю тщательно перемешанной суспензии дрожжей; при этом весь объем углубления должен быть заполнен.

Камеру Горяева помещают на предметный столик микроскопа. Весь большой квадрат сетки должен находиться в поле зрения, поэтому подсчет клеток ведут при общем увеличении микроскопа 200^х (например: объектив – 8^х, окуляр – 10^х, бинокулярная насадка – 2,5^х).

а

б

в

Рис. 2. Счетная камера Горяева: а – вид сверху; б – вид сбоку; в – вид сетки под микроскопом

Некоторые виды дрожжей агглютинируют – клетки слипаются, образуя скопления; при этом их подсчет затруднен. В таких случаях на 50 см³ дрожжевой суспензии добавляют 0,5 см³ серной кислоты, наполовину разбавленной водой. Смесь взбалтывают, оставляют на 25–30 мин, затем, тщательно перемешав, каплю дрожжевой суспензии вносят под притертое покровное стекло.

Для получения достоверных результатов необходимо, чтобы в каждом из 16 маленьких квадратов сетки, составляющих один большой квадрат, находилось не более 10–15 клеток; в противном случае суспензию дрожжей следует развести водой до оптимальной концентрации.

В нашем случае исходную суспензию дрожжей необходимо развести в 10 раз (1:9), т. е. к 1 см³ суспензии добавить 9 см³ дистиллированной воды.

Подсчет клеток осуществляют в пяти больших квадратах сетки (обычно в четырех угловых и одном среднем или по диагонали).

Во избежание повторного учета одной и той же клетки, лежащей поперек линии, разделяющей два малых соседних квадрата, считают клетки, лежащие внутри квадрата и, например, на нижней и правой его сторонах, а клетки, лежащие на верхней и левой сторонах – не считают, так как они входят в число клеток, учитываемых в соседних квадратах.

Поскольку точность определения концентрации клеток в суспензии зависит от того, насколько тщательно притерто покровное стекло, т. е. насколько оно плотно прилегает к поверхности стеклянной пластинки, следует определять количество клеток не менее пяти раз. Необходимо подсчитать клетки в пяти препаратах, приготовленных из одной и той же суспензии, каждый раз насчитывая примерно по 130–160 клеток в каждом из пяти больших квадратов. Общее количество клеток в пяти препаратах составит 650–800 клеток. При этом достоверность данных будет выше, чем при подсчете 650–800 клеток в одном препарате.

Вывод формулы для определения концентрации клеток в суспензии дрожжей с использованием счетной камеры Горяева

Площадь сетки счетной камеры, включающей в себя 225 больших квадратов, составляет 9 мм², поэтому площадь одного большого квадрата равна:

S = 9/225 = 0,04 мм².

Учитывая, что высота углубления, т. е. расстояние между покровным стеклом и поверхностью сетки, составляет h = 0,1 мм, объем столбика суспензии между покровным стеклом и дном углубления, основанием которого служит большой квадрат, равен:

V_кв = S  h = 0,04  0,01 = 0,004 мм³ = 4  10^–6 см³.

Таким образом, объем суспензии дрожжей над пятью большими квадратами сетки составляет:

V₅ = 5  V_кв = 5  4  10^–6 = 20  10^–6 см³.

Концентрацию клеток исходной суспензии дрожжей, т. е. количество клеток в 1 см³, определяют по формуле:

А_i = (a_i /V₅) n = (a_i /20  10^–6) n (3)

где a_i – количество клеток, подсчитанное в пяти больших квадратах сетки счетной камеры; V₅ – объем жидкости над пятью большими квадратами; n – кратность разведения водой исходной суспензии дрожжей.

Пример расчета концентрации клеток в суспензии дрожжей

Количество клеток, подсчитанное в пяти больших квадратах a_i (т. е. сумма клеток в 16  5 = 80 малых квадратах) сетки камеры Горяева каждого из пяти препаратов, заносят в табл. 2.

Таблица 2

Номер препарата	Количество клеток в больших квадратах камеры Горяева					Количество клеток в пяти квадратах ai
	1	2	3	4	5	6
1	142	120	131	138	130	661
2	132	129	140	131	126	658
3	158	123	137	161	153	732
4	123	142	136	135	126	662
5	146	118	150	142	121	677

Концентрацию клеток исходной суспензии дрожжей А_i каждого из пяти препаратов рассчитывают по формуле (3):

А₁ = (661/20  10^–6) 10 = 330  10⁶ клеток в 1 см³;

А₂ = (658/20  10^–6) 10 = 329  10⁶ клеток в 1 см³;

А₃ = (732/20  10^–6) 10 = 366  10⁶ клеток в 1 см³;

А₄ = (662/20  10^–6) 10 = 331  10⁶ клеток в 1 см³;

А₅ = (677/20  10^–6) 10 = 338  10⁶ клеток в 1 см³.

Искомой концентрацией клеток в исходной суспензии дрожжей А_ср считают среднеарифметическое значений А_i:

А_ср = = 338  10⁶ клеток в 1 см³.