Кузнецов А.Е., Градова Н.Б., Лушников С.В. и др. Прикладная экобиотехнология. Учебное пособие. В 2-х томах

Электрохимические биосенсоры относятся к наиболее представительным типам средств для диагностики и мониторинга загрязнений. Они создаются на основе проточных систем, иммобилизованных клеток, клеточных органелл, ферментов и представляют собой устройства, использующие биологические материалы для «узнавания» (анализа) определенных молекул и выдающие информацию об их присутствии и количестве в виде электрического сигнала. В биосенсорах используется в виде электрода электрохимический датчик с иммобилизованным на его поверхности биоматериалом. Создано и исследовано много систем, которые апробированы и промышленно реализованы. Они обладают простотой, селективностью, стабильностью. Большинство биосенсоров ориентировано на анализ биологических жидкостей.

Рис. 10.1. Принципиальная схема биосенсора (по С. Д. Варфоломееву, 1997)

Биосенсор типичной конструкции состоит из двух принципиальных функциональных элементов: биоселективной мембраны, содержащей различные биологические компоненты, и физического преобразователя сигнала (трансдьюсера), трансформирующего концентрационный сигнал в электрический. Для считывания и записи информации применяют электронные системы усиления и регистрации сигнала. В качестве биоселективного материала используют ферменты, антитела, рецепторы, нуклеиновые кислоты и живые клетки (рис. 10.1). Трансдьюсерами могут быть электрохимические преобразователи (электроды), различного рода оптические преобразователи, гравитационные, калориметрические, резонансные системы. Все виды биоселективных элементов можно комбинировать с различными трансдьюсерами. Это создает большое разнообразие различных типов биосенсоров. Наибольшее развитие получили ферментные и клеточные биосенсоры (рис. 10.2).

Рис. 10.2. Принципиальная конструкция биохимического сенсора: 1 – исследуемый раствор; 2 – корпус биосенсора; 3 – полупроницаемая мембрана (для механического удерживания биослоя); 4 – слой биоматериала; 5 – физический преобразователь (электрод, пьезокристалл, оптоволоконный материал и т. д.); 6 – усилитель сигнала; 7 – регистратор (дисплей, цифровой или световой указатель)

Простейший случай в конструировании ферментного биосенсора реализуется при условии, что либо субстрат, либо продукт ферментативной реакции электрохимически активны, т. е. способны быстро и желательно обратимо окисляться или восстанавливаться на электроде при наложении на него соответствующего потенциала. Например, биосенсор для определения глюкозы основан на реакции ее окисления глюкозооксидазой.

Глюконовая кислота

Соответственно электрохимическая детекция процесса может быть организована путем регистрации тока восстановления кислорода или пероксида водорода. Оба случая реализованы на практике. В амперометрических биосенсорах поток электронов через поверхность датчика линейно связан с концентрацией анализируемого вещества в растворе.

Наиболее ярким примером ферментных биосенсоров являются люциферазные биодатчики, в которых тестируемые вещества обнаруживаются по их влиянию на кинетику реакции биолюминесценции. Датчики конструируются на основе растворимой и иммобилизованной светлячковой и бактериальной люциферазы. Разработаны методики с использованием люциферазного датчика для анализа загрязнения воздушной среды акрилонитрилом, биотесты для опре-

деления загрязнения кожи людей соединениями платины, определения степени хирургических эндотоксикозов, степени поражения зерна микроскопическими грибами, биотестирования сточных вод предприятий целлюлозно-бумажной промышленности.

Много различных биосенсоров создано с использованием живых иммобилизованных клеток растений, животных, человека, но наибольшее применение нашли клетки микроорганизмов. В отличие от ферментов при использовании клеток не требуется дорогостоящих стадий очистки. Имеющиеся методы иммобилизации позволяют получать клетки, сохраняющие активность ферментов

испособные функционировать достаточно длительные промежутки времени, в некоторых случаях в течение нескольких лет. Клетки сохраняют, как правило, все ферментные стадии регенерации кофакторов. Это позволяет проводить сложные последовательные реакции, осуществляя многостадийные процессы. Для многих типов клеток, особенно микробных, разработаны методы получения мутантов с высоким содержанием того или иного белка или фермента, что дает возможность оперировать с высокоэффективными каталитическими системами. Поскольку клетки сохраняют аппарат биосинтеза белка, потенциально могут быть разработаны чувствительные методы генодиагностики.

Для создания клеточных биосенсоров, так же как и ферментных, используются самые различные физические трансдьюсеры: электрохимические, включая амперометрические (детекторы кислорода, пероксида водорода, медиаторы), потенциометрические (pH-чувствительные и ионоселективные электроды, pH-чувствительные полевые транзисторы), кондуктометрические, оптические, акустические, калориметрические. Развитие получили биосенсоры с использованием техники LAPS (светоадресуемых потенциометрических сенсоров). LAPS-система достаточно чувствительна, и на ее основе были созданы системы слежения за физиологическим состоянием отдельных клеток – так называемые микрофизиометры.

Применение клеточных биосенсоров достаточно многообразно. Созданы биосенсоры для селективного определения пролина, глутамина, тирозина, молочной и аскорбиновой кислот, глюкозы, спиртов, формальдегида, фенолов и хлорфенолов, пестицидов. Возможен экспресс-анализ метана, сероводорода, сульфат-иона, аммония, монометилсульфата, тяжелых металлов, суммарной токсичности, БПК, интегрального качества воды и сточных вод. В отличие от традиционных методов, требующих для получения данных несколько дней, биосенсоры с иммобилизованными клетками позволяют получать эти же данные в течение нескольких минут. Чувствительность бактериальных биосенсоров составляет 10–100 мкг/л, датчиков с антителами – 0,1 мкг/л и менее.

Многие загрязнения окружающей среды являются мутагенами или промутагенами (т. е. могут приобретать мутагенные свойства в результате метаболизма или при сочетании с другими компонентами, циркулирующими в окружающей среде), обладают канцерогенными свойствами. Ряд продуктов производственной деятельности человека генетически активны. Это могут быть не только отходы химических производств, но и некоторые лекарства, консерванты, пищевые добавки

икрасители, косметика, инсектициды и пестициды, радиоактивное излучение.

Выявление и устранение генетически активных факторов из среды обитания человека – задача генетической токсикологии, которая представляет собой наиболее активно развивающийся раздел экологической генетики.

Экологическая генетика – сравнительно молодая область биологии. Объектом ее исследований является генетика популяций в природных условиях и взаимовлияние генетических процессов и экологических отношений. Учитывая специфику проявления генетического воздействия на организм, не всегда можно определить мутагенный эффект того или иного воздействия, однако в ряде случаев можно выявить влияние на кроссинговер, т. е. на рекомбинацию генов, или индукцию репаративного синтеза ДНК, сопровождающего многие повреждения генетического материала.

Мутагенез, рекомбинация и индукция репаративного синтеза ДНК являются показателями генотоксичности или генетической активности исследуемого фактора. Прямые исследования действия предполагаемых мутагенных факторов на человека невозможны, поэтому их проводят на эколого-генетических моделях. Получаемые результаты в значительной степени справедливы и для человека в связи с биологической универсальностью свойств генетического материала.

Для оценки мутагенной и канцерогенной активности химических соединений разработано более 100 методов. Ряд факторов могут быть мутагенны для одних биологических объектов и быть безразличны в генетическом отношении для других. Поэтому в качестве тест-объектов применяются самые различные виды организмов – от бактериофагов и вирусов до млекопитающих и клеточных тесткультур человека в условиях in vivo и in vitro. Важнейшие из них – учет мутаций у микроорганизмов (мутатест, тест Эймса), цитологический анализ модельных растений и млекопитающих, регистрация хромосомных аберраций и сестринских хроматидных обменов в лейкоцитах человека, дефектных по генам репарации, учет изменений на уровне ДНК – разрывы и другие повреждения, эксперименты по связыванию с ДНК, индукция трансформации клеток и т. д. Автоматизированные методы – на основе SOS-хромотеста, анализа кинетики размножения фагов, автоматического учета кариотипов ряда высших организмов.

Использование штаммов микроорганизмов, генотип которых хорошо изучен, позволяет быстро и надежно выявить мутагенные факторы. Наиболее широкое распространение для первичного выявления генетической активности получил так называемый тест Эймса (по имени американского исследователя, разработавшего эту систему в 60-е гг. XX в.). Суть теста Эймса заключается в том, что изучаются реверсии гистидиновых мутантов сальмонелл (Salmonella typhimurium, штаммы ТА 98 и ТА 100) в результате воздействия различных мутагенов, т. е. изучается восстановление у них способности синтезировать гистидин и, следовательно, расти на среде без гистидина.

В настоящее время тест Эймса усовершенствован: наряду с хорошо изученными мутациями потребности в гистидине в геном сальмонеллы вводят делецию по одному из генов репарации, т. е. инактивируют этот процесс, тем самым повышают чувствительность бактерии к мутагенам. Вводят также мутацию, блокирующую синтез липополисахаридной капсулы для повышения проницаемости клеток, а также плазмиды, повышающие чувствительность клеток к агентам,

10.3.1.Биоиндикация в воздухе

Биоиндикация вредных веществ в воздухе основана на их проникновении в живые организмы. Действие загрязнений воздуха на живые организмы можно выявить при использовании как активного, так и пассивного мониторинга.

При активном мониторинге в контрольную и экспериментальную камеры помещают однородные по морфологии, возрасту, генетическим особенностям экземпляры тест-организма – растения или животного, особо чувствительного к загрязнениям воздуха. В течение определенного экспериментального периода в камерах поддерживаются стандартные условия с циркуляцией подаваемого воздуха, при этом в экспериментальную камеру поступает неотфильтрованный воздух, а в контрольном варианте происходит постоянная фильтрация вредных веществ. В упрощенном варианте, при отсутствии тест-камер, отобранные биоиндикаторы помещаются с соблюдением возможно более сходных условий в экспериментальное помещение и спустя некоторое время обследуются на воздействие на них загрязнений. Перечень биоиндикаторов, которые дают положительные результаты при оценке воздействия определенных загрязнений, представлены в табл. 10.1.

Таблица 10.1.

Биоиндикаторы вредных веществ в воздухе (по кн. «Биоиндикация загрязнений наземных экосистем», 1988)

При пассивном мониторинге атмосферного воздуха для изучения последствий загрязнения используются индикаторные свойства свободно живущих организмов исследуемой области. Сложность такого мониторинга обусловлена реакцией биоиндикатора на весь комплекс загрязнений при данных условиях экотопа. Поэтому одновременно проводят исследования разных биоиндикаторов, биоценозов, особенно растительных (эпифитных лишайников, мхов) и микробных сообществ, анализируют популяционно-экологические и химические изменения пищевых сетей при параллельном контроле важных абиотических факторов окружающей среды. В растительных сообществах по мере увеличения степени загрязнения вначале уменьшается видовое разнообразие, возможно разрежение сомкнутого растительного покрова за счет повреждения отдельных наиболее чувствительных экземпляров. Еще более продолжительное действие загрязнений при высокой их концентрации может в конце концов привести к полному отмиранию растительности. В микоценозах заметно уменьшается число плодовых тел микоризных грибов.

Результаты биоиндикационных исследований являются основой для разработкимер,направленныхнауменьшениевредноговоздействиязагрязненийатмосферного воздуха. В частности, в городском хозяйстве необходимо зеленые насаждения составлять из пригодных для данной местности пород деревьев с учетом влияния промышленных и транспортных выбросов. Воздухоочистительная функция зеленых насаждений может быть объединена с ветрозащитной и разделительной.

10.3.2. Биоиндикация водных экосистем

Методы биоиндикации и биотестирования широко используются при определении общей токсичности природных и сточных вод.

Загрязнение водных экосистем приводит к изменению физико-химических характеристик воды, изменению индекса сапробности (см. разд. 1.1.2), уменьшению индекса видового разнообразия, накоплению загрязнений в тканях гидробионтов, изменению качественного соотношения видового состава биоценоза, численности видов-индикаторов. Меняются морфологические, анатомические и физиологические характеристики особей.

В загрязненной полисапробной и -мезосапробной зонах развиваются анаэробные бактерии, сапрофитные грибы (Fusarium, Penicillium, Mucor и др.), количество водорослей минимально, развивается сульфатредукция, ил приобретает черноватый оттенок из-за образования сульфида железа.

При комплексном гидробиологическом анализе определяют ряд параметров на фитопланктон, зоопланктон, зообентос, перифитон, растения-макрофиты, микробиологические показатели с учетом основных групп гидробионтов, в том числе: общую биомассу, численность, проективное покрытие макрофитами, число видов, численность по группам, число видов в группе, индекс видового разнообразия, преобладающие виды, зону сапробности преобладающих видов и их долю от общей численности, отношение интенсивности фотосинтеза к деструкции органического вещества, содержание хлорофилла и др.

При оценке индекса видового разнообразия (см. разд. 1.4.1.3) принимают во внимание численность плоских и кольчатых червей, моллюсков, водных клещей, мелких ракообразных, личинок паденок, веснянок, двукрылых жуков, стрекоз, кровососущих двукрылых мошек и других организмов. В частности, для личинок мошек, которые не живут в стоячей воде, особенно губительны загрязнения нефтяными продуктами, пестицидами, соединениями цинка.

Хорошими индикаторами радиоактивного загрязнения в водных экосистемах являются некоторые высшие растения (Lemna trisulca, L. minor, Potamogeton perfoliatus, Myriophyllum spicatum), одноклеточные (pp. Scenedesmus, Chlorella) и многоклеточные (Cladophora) водоросли.

Одним из методов определения общей токсичности природной и сточной воды, тяжелых металлов и других веществ является биотестирование с использованием коловратки Brachionus plicatilis. Определяют два показателя – выживаемость и нарушение фототаксиса, которые характеризуют гибель и снижение численности передвигающихся к свету коловраток, в процентах от контроля. Тестирование занимает от 15 мин до 24 ч – по критерию нарушения фототаксиса, до 24–96 ч – по критерию выживаемости. Показатель нарушения фототаксиса коловраток применяется для биотестирования веществ, не обладающих острой токсичностью, так как при действии данных веществ нарушение фототаксиса наблюдается при концентрациях значительно ниже тех, которые вызывают гибель организмов. Показатель выживаемости используется при биотестировании веществ, обладающих острой токсичностью, так как в этом случае нарушение фототаксиса и гибель организмов наблюдаются при близких концентрациях.

Другим методом определения общей токсичности воды является биотестирование с использованием рачков – дафний (p. Daphnia), распространенных повсеместно. Тестирование в остром опыте занимает 96–120 ч и позволяет определить наличие или отсутствие острого токсического воздействия на дафнии контролируемой воды или испытуемого вещества. Основным показателем токсичности является выживаемость рачков. В хроническом опыте проводят более полное, тщательное исследование токсических свойств сточных и природных вод или отдельных веществ. Основные показатели – выживаемость, плодовитость, качество потомства и рост в ряду поколений. Метод биотестирования с использованием дафний рекомендован в качестве основного для контроля токсичности сточных вод и перспективного для оценки уровня токсического загрязнения природных вод (см. приложение 2).

Разработаны биоиндикационные методы исследования воды, загрязненной металлами. Так, предлагается ряд тест-систем для определения токсикологических характеристик воды, загрязненной кадмием. Для этого используют тростниковую заросль Glyceria maxima, в листовых пластинках, влагалищах и стеблях которой происходит накопление кадмия в зависимости от концентрации в питательной среде. Одновременно при высоком содержании кадмия наблюдаются сильное уменьшение биомассы и морфологические изменения (побурение кончиков листьев, хлороз) растений.

В качестве второй тест-системы предлагаются макроводоросли. Определяемую концентрацию Cd2+ – от 5 до 500 мкг/л по металлу сопоставляют с изменением окислительной активности среды.

Третьей тест-системой могут быть бентосные животные (жабры двустворчатых моллюсков-беззубок Anodonta anatina, мягкие ткани Dreissena polymorpha и Lymnaea auricularia), хищные и нехищные рыбы (жабры и почки), планктонные ракообразные, водные улитки. Определяемая концентрация Cd до 60 мг/ кг сухой массы. Для измерения содержания Cd в организмах используют метод атом- но-абсорбционной спектрофотометрии.

Определить кадмий можно с помощью тест-системы морских светящихся бактерий (Photobacterium phosphoreum). Определяемая концентрация – до нескольких сот мг/л. Для измерения используют биолюминесценцию бактерий. Эту тест-систему можно использовать и для определения никеля (Ni2+) в концентрациях до нескольких сот мг/л.

Для определения кобальта можно использовать в качестве биологического объекта почки и чешую рыб, а также поденки и хирономиды. Анализируют количественное соотношение в них элементов в парах Cu/Mn, Zn/Cu, As/Co, Ca/Zn, P/Zn. В случае статистически достоверного изменения полученных данных в опыте по сравнению с контролем исследуемый водоем считают загрязненным.

Для определения марганца в качестве биологического объекта используются мозг, почки, селезенка и жаберные дуги рыб; раковины моллюсков и хирономид. Так же как и при определении кобальта, анализируют количественное соотношение в них элементов в парах Cu/Mn, Zn/Cu, As/Co, Ca/Zn, P/Zn.

Для определения меди пригодны разные тест-системы. Медь (Сu2+) может определяться в сточных водах биотестированием по уровню двигательной активности инфузории спиростомы Spirostomum ambiguum var. major Ehrb. – крупной инфузории, достигающей длины 200–300 мкм. Анализируется уровень спонтанной двигательной активности спиростомы по числу пересечений ею линии визира окуляра микроскопа. При наличии в сточных водах ионов Сu2+ в концентрации до 10–3 мг/л потеря подвижности инфузорий наблюдается через 15 мин, а гибель через 2 ч после помещения их в раствор. При концентрации Cu2+ 10–12 мг/л гибель инфузорий наступает в течение первых суток. Также предлагается использовать рыбу уклейку (Alburnus alburnus). Определяемая концентрация 200 мг/л по металлу. Изменения фиксируют методом электронномикроскопических исследований.

При использовании эндемичных байкальских губок Lubomirskia baicalensis и Baikalospongia bacillifera определяемая концентрация меди 4–400 мг/л. Эти организмы подходят и для определения ртути (Hg2+). Определяемая концентрация 0,3–120 мг/л. Действие металлов проявляется в потере губками способности к соединению с образованием ирригационных каналов.

Кроме этих тест-систем используются дрожжи (Saccharomyces cerevisiae) и инфузории (Tetrahymena pyriformis). Определяемые концентрации меди 0,1 мг/л, ртути 0,4 мг/л регистрируются по нарушению процессов дыхания клеток.

Аналогичные методы применяют к определению свинца, хрома, цинка.