Кузнецов А.Е., Градова Н.Б., Лушников С.В. и др. Прикладная экобиотехнология. Учебное пособие. В 2-х томах

отличие от высших растений, хлоропласты для них не являются строго необходимой частью для сохранения жизненной активности.

Широкое распространение получили методы биотестирования, основанные на изучении роста особей простейших (инфузории) и низших животных (рачки дафнии и др.). Эти тест-объекты, характеризующиеся относительно коротким жизненным циклом развития, хорошей приживаемостью в лабораторных условиях, позволяют получать экспресс-информацию, отражающую интегральное качество окружающей среды. Наиболее известные примеры тест-объектов – инфузории Tetrahymena pyriformis, Paramecium caudatum, рачки Daphnia magna (см. описание методик биотестирования, приведенное в приложении 2), а также рачки Thamnocephalus platyurus, Ceriodaphnia dubia, C. affinis, Acartia tonsa, коловратки Brachionus plicatilis.

Простейшие и дафнии часто используются для определения токсичности проб воды, ее санитарно-гигиенического контроля, оценки качества очистки воды в очистных сооружениях. Рачки особенно чувствительны к тяжелым металлам, мышьяку. Мышьяк для планктоных рачков, дафний и циклопов смертелен в концентрациях 0,25–2,5 мг/л (для сравнения для рыб – 10–20 мг/л). Соединения свинца вызывают гибель рачков при концентрации 0,5 мг/л (рыбы погибают при концентрации свинца 10–150 мг/л). ЛК50 (летальная концентрация, при которой гибнет 50% особей) кадмия составляет для дафний 0,05 мг/л.

В лабораторных тестах с простейшими и планктонными рачками анализируют такие показатели, как изменение выживаемости и плодовитости тестживотных, подвижность особей, нарушение фототаксиса. При кратковременном биотестировании (до 96 ч) определяют острое токсическое действие, а при длительном (20 и более суток) – хроническое токсическое действие на тестживотных.

Клеточные культуры и ранние зародыши экспериментальных животных при культивировании in vitro являются удобными тест-системами для оценки мутагенного и канцерогенного потенциала химических соединений. Для характеристики токсичности вещества по отношению к клеточным культурам (цитотоксическое действие) используется показатель 50%-й гибели клеток – CD50 (50% cell death).

При биоиндикации на тканевом или организменном уровне наиболее широко используются растения. В порядке возрастания толерантности (устойчивости) организмов к действию загрязнений растения можно расположить в следующий ряд:

мхи и лишайники > хвойные > травянистые > листопадные.

Использование мхов и лишайников в качестве тест-систем нашло применение в системах экологического мониторинга многих стран. Мхи и лишайники отрицательно реагируют (до полного их исчезновения) на содержание в воздухе различных загрязнений. Высокая чувствительность мхов и лишайников к действию загрязнений определяется рядом их физиологических особенностей. В частности, у мхов отсутствует малопроницаемая для газов кутикула – защитная жировая

пленка. Тонкие листовые пластины мхов позволяют им эффективно отфильтровывать и накапливать тяжелые металлы из сильно разбавленных сред.

Лишайники накапливают тяжелые металлы в талломе. При увеличении концентрации загрязнений в наземно-воздушной среде снижается видовое разнообразие лишайников. Наиболее устойчивыми к загрязнению являются накипные лишайники, а наименее устойчивыми – кустистые. Снижается численность эпифитных лишайников, уменьшается размер их таллома, интенсивность окраски. При этом в первую очередь страдает водорослевый компонент лишайника.

Под действием загрязнений у высших растений проявляются как морфологические, так и физиолого-биохимические изменения. К морфологическим изменениям высших растений относят изменение окраски листьев, увядание, отмирание, опадение и т. п.

Под воздействием ряда вредных газообразных веществ (SO2 и др.) и тяжелых металлов наблюдается хлороз, признаками которого являются бледная окраска листьев между жилками или сосновой хвои; пожелтение краев или участков листьев у лиственных пород под действием хлоридов; покраснение в виде пятен, например, на листьях смородины под действием SO2; побурение (бронзовение) листьев у лиственных пород и хвои у сосен и елей под действием газов, входящих в состав дыма; серебристая окраска листьев у травянистых растений (табак) под действием озона и др.

Некроз (отмирание ограниченных участков ткани листа или хвои) наблюдается, например, у листьев табака, бегонии при действии озона и у лип при действии SO2. Краевые некрозы листа характерны для лип при действии на них соли, применяемой для ускорения таяния снега и льда; верхушечные некрозы листа часто возникают у хвойных (ель, сосна, пихта) под действием SО2; линейные некрозы характерны для листьев однодольных растений при действии на них газов, входящих в состав дыма; некрозы околоплодника поражают цветки, часто при действии SО2 на двудольные растения. У малины SO2 вызывает увядание листовой пластинки. При развитии некрозов вначале изменяется окраска, затем пораженные участки высыхают, разрываются, выцветают или окрашиваются в бурый цвет за счет дубильных веществ. Другие загрязнения приводят к развитию хлорозов, некрозов листвы или хвои, изменению их размеров и опадению. Хвоя удлиняется под действием нитратов и укорачивается при действии SO2. У ягодных кустарников дым уменьшает площадь листа. Действие радиоактивного облучения или гормональных гербицидов проявляется в аномальной конфигурации листьев, искривлении побегов, сращении или расщеплении отдельных органов, увеличении или уменьшении числа частей цветка и т. д. Изменение формы роста и ветвления (кустовидные, подушечные деревья) часто возникает при сильном загрязнении атмосферы. Изменение плодовитости (черника, ель, уменьшение образования плодовых тел у лишайников) также характерно для растений в загрязненной газообразными выбросами атмосфере.

Биоиндикацию многолетнего воздействия антропогенных факторов на растительность можно проводить по ширине годичных колец у контрольных деревьев. Биологическим индикатором служит также прирост длины горизонтальных ветвей взрослых деревьев.

Биоиндикаторами могут быть самые распространенные растения на изучаемой территории, для которых хорошо изучены их физиологические характеристики. Однако, перед тем как выделять в качестве индикатора какой-либо вид или группу видов, необходимо выявить лимитирующие факторы, влияющие на растения, включая загрязнения, оценить возможности компенсации или адаптации растений к этому фактору. Численные соотношения разных видов популяций и целых сообществ часто служат лучшим индикатором, чем численность одного вида, и дают интегральную оценку условий окружающей среды.

В водных экосистемах биоиндикаторами загрязнения могут быть такие растения, как ряска и растения-макрофиты. Рясковые реагируют на загрязнение снижением количества и отрицательным фототаксисом хлоропластов в листецах растений. Ряска малая (Lemna minor) и ряска тройчатая (Lemna trisulca) чувствительны к загрязнению воды при содержании в ней до 10 мг/л ионов Ва, Сu, Mg, Fe, Со, при этом реакция рясок (рост, изменение окраски листеца, характер соединения листецов) на каждый вид загрязнения специфическая.

Растения-макрофиты способны накапливать преимущественно растворенные в воде металлы и в течение продолжительного времени удерживать их в своем организме, по-разному в разных частях растения, что используется в биомониторинге. Изучая содержание тяжелых металлов в разных частях растения, а также в разновозрастных растениях, можно проследить изменение уровня загрязнения водной среды во времени (сезонные и годичные).

Основной критерий, по которому определяется состояние фитоиндикатора в лабораторных условиях, – уровень фотосинтеза. Активность фотосинтеза определяет жизнеспособность растений, их урожайность и хорошо отражает все изменения среды обитания. Но уровень активности фотосинтеза непосредственно трудно измерить, поэтому используются косвенные индикационные признаки – сухая биомасса, количество растворимых белков, активность отдельных ферментов, например пероксидазы, цитохрома P450 и др. Наблюдается прямая корреляция между степенью влияния на экосистему и снижением активности фотосинтеза. В зеленых наземных частях растений снижаются сухая биомасса, концентрация растворимых белков и активность фотосинтетических ферментов.

По уровню ферментативной активности систем, осуществляющих биотрансформацию ксенобиотиков, интенсивности протекания свободно радикальных процессоввтканях,уровнюактивныхформкислорода,активностиантиокислительных систем можно биотестировать воздействие таких поллютантов, как полихлорированные бифенилы. Для этой же цели измеряют коэффициент проницаемости мембран клеток и протопластов растения табака, который изменяется в результате быстрой модификации липидного бислоя мембран растительной клетки.

Информативными, технически простыми являются методы фитотестирования загрязнения почвы с семенами растений. Определяют всхожесть семян и активность их прорастания (измеряется длина проростков и корешков). В качестве тест-систем используют семена злаковых (пшеница, овес, маис и др.), бобовых (клевер, фасоль обыкновенная), масличных (подсолнечник) и быстро всхожих овощных культур (кресс-салат, горчица, огурцы, репа, редиска, репчатая капуста, турнепс и др.).

Для оценки токсичности воды разработан биотест с измерением скорости движения протоплазмы в клетках элодеи, аналогичный такому же тесту с харовыми водорослями.

Вкачестве биоиндикатора может использоваться пыльца растений. Ее форма, размер и симметрия меняются под влиянием антропогенных факторов. Так, сигаретный дым и бенз(а)пирен, сорбируясь на внешней оболочке пыльцы, изменяют морфологию поверхности пыльцевых зерен, способствуют их слипанию и образованию конгломератов. Загрязнения атмосферного воздуха (СO,

NO2, SO2) изменяют поверхность и форму пыльцевых зерен, нарушают целостность их оболочек. Чувствительным биоиндикатором загрязнения окружающей среды является пыльца ежи сборной (Dactylis glomerata). Пыльцевые зерна травянистых растений повреждаются загрязнениями сильнее пыльцы деревьев и кустарников.

Вкачестве тест-систем используются и животные. У беспозвоночных животных определяют различные формы анатомо-морфологических реакций на антропогенные воздействия: изменение размеров тела и отдельных органов (длины, ширины, массы, пропорций и т. д.); изменение микроструктуры поверхности тела (склеротизация, зернистость и др.); изменение окраски тела или отдельных его частей.

Из гидробионтов чувствительными биоиндикаторами являются двустворчатые моллюски-фильтраторы – Anodonta anatina, Dreissena polumorpha, Abra alba, водные брюхоногие улитки Lumnaea auricularia. Двустворчатые моллюски ведут оседлый образ жизни, что позволяет получать данные, отражающие изменения во времени. Для биоконтроля токсичности буровых растворов в качестве биологического тест-объекта используют мизидовых креветок (Mysidae).

На уровне популяции в качестве индикаторов используются насекомые, например жужелицы и стафилиниды. Определяются такие индикационные признаки, как общая численность, количество видов, численность популяций, биомасса, трофические группы, экологические индексы. Эти группы хорошо отражают нарушение экосистем сменой своих видов. В нарушенных экосистемах большие специализированные виды заменяются космополитными видами.

Заметные отличия наблюдаются в структуре и зернистости покровов наземных беспозвоночных, окраске тела насекомых (индустриальный меланизм, проявляющийся в заметном потемнении первоначально светлых форм насекомых), живущих на загрязненных и незагрязненных территориях. Наиболее пригодны для этих целей равнокрылые (тли) и жесткокрылые (жужелицы, листогрызы и др.). Изменение их структуры достаточно хорошо выявляется под бинокулярным микроскопом. Изменение окраски на загрязненных территориях отмечено

идля других групп насекомых и беспозвоночных: пауков, шмелей, ногохвосток травянистого яруса, наземных брюхоногих моллюсков и др. Поэтому данный показатель в совокупности с другими может использоваться при оценке состояния наземных экосистем.

Кольчатые черви в большинстве своем обитают в стоячей пресной воде. Все они питаются нанопланктоном. В водных системах кольчатые черви являются важным звеном трофических цепей и служат пищей малькам многих видов рыб.

Удобство использования кольчатых червей как биоиндикаторов объясняется строгой закономерностью развития организма, возможностью использования клонов, полученных партеногенетическим путем и поэтому характеризующимися однородностью популяции и одинаковой чувствительностью к токсичным веществам. Кольчатые черви выполняют роль индикаторных организмов при перепроверке результатов, полученных в естественных натурных условиях. Ввиду простых условий выращивания, удобства измерений и получения документированных результатов кольчатые черви особенно удобны для лабораторных испытаний, при проведении ретроспективных и прогнозных экотоксикологических исследований химических веществ, оказывающих влияние на окружающую среду. Лабораторные испытания длятся, как правило, 3–4 недели. Они позволяют сделать заключение о степени нанесенного вреда на основании измерений плотности заселения, числа отложенных яиц, уровня их развития.

Индикатором для сельскохозяйственных угодий могут быть дождевые черви Eisenia foetida и Lumbricus terrestris (см. разд. 3.3.1). Биотестирование проводят для определения интегральной токсичности почвы с целью проверки соответствия качества почвы нормативным требованиям. Экологическими индексами являются их численность и количество видов, совокупная биомасса, которые отражают состояние почвы, степень ее изменения. В лабораторном экспресстесте на загрязненность почвы отслеживают реакцию избегания червей загрязненной почвы в контакте с чистой. Время теста 2 сут, в отличие от стандартных тестов на репродуктивность (56 сут) и острого теста на сублетальность. Тип контрольной почвы менее значим в этом тесте, чем уровень загрязненности.

Кольчатые черви энхитреиды (Enchytraeus crypticus и др.) более чувствительны к действию различных токсикантов, -излучению и другим воздействиям, чем дождевые черви. Вид E. crypticus хорошо размножается и развивается при комнатной температуре, его цикл развития составляет 3 нед, что существенно короче цикла дождевых червей, особи мелкие (5–10 мм в длину), что позволяет экономить место под контейнеры с пробами. В тест-системах с энхитреидами анализируют количество отложенных яиц, форму кладки, количество особей, выживаемость взрослых особей и молоди. Данные тест-системы все более широко используются из-за неприхотливости тест-объектов и их универсальности, т. е. способности к проживанию в широком диапазоне почв.

Из других представителей почвенных беспозвоночных животных в качестве тест-объектов используются нематоды (рр. Aphelenchus, Acrobeloides, анализируется численность) и ногохвостки (Collembola).

Позвоночные животные лишь косвенно свидетельствуют о состоянии окружающей среды, поэтому в целях биоиндикации они применяются реже. Индикаторами служат птицы: их пространственное распределение, видовой состав, изменение численности, доминирование, изменение окраски (явление альбинизма у городских популяций птиц: воробьев, голубей, ворон) и другие характеристики. Возможно использование амфибий, рептилий. Зооиндикаторами являются грызуны родов Microtus (серые полевки) и Apodemus (полевые мыши). Эти два рода довольно часто встречаются, и их экологические потребности хорошо изучены. Индикационными признаками могут являться масса организма, масса

его органов (печени, почек), содержание тяжелых металлов (Cd, Pb, Hg, Zn, Cu) в органах и шерсти, активность ряда ферментов.

Рыбы могут использоваться при определении острой и подострой токсичности. В водных экосистемах по чувствительности к облучению и его химическим аналогам на первом месте стоят рыбы, затем ракообразные и моллюски, за ними водоросли и бактерии. На другие химические вещества рыбы реагируют слабо по сравнению с планктоном и многими ракообразными, однако токсические воздействия на рыб оказываются более многообразными. Рыбы могут усваивать вредные вещества через кожу, жабры и желудок, поэтому перед проведением токсикологических опытов необходимо иметь предварительные данные о поведении веществ в водных системах, характере переноса в пищевых цепях, с тем чтобы выбрать подходящий для данных условий окружающей среды способ введения вещества в организм – парентеральный (через кожу), пероральный (через рот, желудок) или через воду (через жабры). Ключевыми данными для оценки биологической активности в сублетальной области являются изменения внешних и внутренних процессов жизнедеятельности рыб (изменения в ее органах и функциональные нарушения). Виды рыб для испытаний выбирают, исходя из критерия максимальной и минимальной чувствительности вида; в качестве модельных видов часто используют карпа (минимально чувствительный) и форель (максимально чувствительный), в лабораторных тест-системах – аквариумных рыбок гуппи (Poecilia reticulata Peters).

Использование гнотобиотических систем (искусственных миниэкосистем) и микрокосмов позволяет воспроизвести важнейшие составляющие природных условий, смоделировать отдельные свойства природных экосистем и предсказывать некоторые особенности их реакции на стрессовые условия, а также поведение загрязняющих веществ, интродуцируемых микроорганизмов (в частности, рекомбинантных) в реальных условиях. Целью такого подхода является выявление потенциально вредных воздействий на определенные популяции в экосистеме, связанные с присутствием постороннего вещества. При этом возможно проводить исследования в различных сочетаниях с использованием стандартных микробиологических методов: на чашках Петри, в пробирках, в колбах, что значительно ускоряет исследования и снижает их стоимость.

Все лабораторные модели гнотобиотических систем и микрокосмов имеют собственную динамику; тем самым их соответствие реальным природным условиям ограничено. Поэтому в качестве анализируемых параметров берут лишь такие, методы измерения которых достаточно просты, репрезентативны и чувствительны по отношению к загрязнениям.

Один из наиболее информативных показателей состояния таких экосистем – коэффициент энергетического обмена, рассчитанный по формуле

(10.1)

где Б – биомасса, Д – энергия или вещество, расходуемые на дыхание; П – энергия или вещество, переходящее в новое органическое вещество.

В условиях загрязненности природных сред (воды, почвы) расходование органического вещества происходит более активно на процессы дыхания и менее активно – на прирост биомассы, т. е. при стрессовых воздействиях на систему показатель Д всегда возрастает, а показатель К уменьшается.

Для описания изменений в почвенной экосистеме часто используют дыхательный коэффициент qCO2 – отношение почвенного фонового дыхания (Rb) к углероду почвенной микробной биомассы (Cmic):

Поскольку часто Cmic точно определить сложно, вместо Cmic используют суб- страт-индуцированное дыхание почвенных микроорганизмов (Rs) при добавлении субстрата (глюкозы или другого) в почву, пропорциональное Cmic, а величину qCO2 заменяют на QR. Чем больше QR (qCO2), тем больше загрязнена почва. Значения QR изменяются от 0,01–0,1 до 1–10.

В методе мультисубстратного тестирования анализируют QR или другие показатели при добавлении в почву большого числа различных субстратов. Это позволяет охарактеризовать и классифицировать природные сообщества микроорганизмов по функциональным свойствам.

Другим информативным показателем может являться конкурентное равновесие различных видов. При изменении условий окружающей среды конкурентное равновесие претерпевает кратковременные или длительные нарушения, в результате развиваются лишь немногие из конкурирующих видов.

Моделирование в микрокосмах трофических цепей питания позволяет проследить процессы накопления вредных веществ и их сублетального воздействия по мере прохождения по цепи питания. На практике искусственные модели цепей питания водных систем осуществляют с зелеными водорослями и дафниями. В этой системе можно наблюдать прямые проявления вредного воздействия отдельно для каждой популяции, а также косвенные воздействия по данным о снижении потребления пищи.

Для наземных экосистем изменения условий окружающей среды, моделируемые в микрокосмах, относительно легко выявляются измерением интенсивности жизнедеятельности почвенной микрофлоры. При этом чаще всего применяют совокупность таких методов исследования, как изучение дыхания почвы, определение активности ферментов, выделение тепла (микрокалориметрия), а также измерение концентрации ATP.

Фактическое состояние природных экосистем определяется сопоставлением состояния индикаторов – отклонением их индикационных признаков от фонового (оптимального) состояния (в % к фоновому). Важны показатели, характеризующие видовую структуру, генетическую гетерогенность и разнообразие биоценозов (см. разд. 1.4.1.3), величина первичной продукции, скорость круговорота биогенных веществ, а для водных систем – индекс качества воды и индекс сапробности (см. разд. 1.1.2). В частности, снижение величины индекса видового разнообразия (индекса Шеннона) может свидетельствовать о неблагоприятных изменениях в биоценозах под воздействием загрязнения или других

антропогенных факторов. Комбинируя разные биоиндикаторы и в зависимости от распределения отклонений по трофическим уровням индикаторов (биохимической активности, численности популяций и индивидов и др.) можно судить о степени и характере изменений. Совокупность характерных для изучаемой территории биоиндикаторов и ключевых участков позволяет экстраполировать выявленные изменения на более крупные географические единицы, составить карту состояния окружающей среды и на этой основе прогнозировать состояние любой экосистемы соответствующего типа, дать рекомендации об оптимальной хозяйственной деятельности на данной территории.

Важное значение имеют экспресс-методы биотестирования на основе биохимических измерений, молекулярно-генетических, иммуноферментных методов анализа, биосенсоров.

Биохимические, молекулярно-генетические методы позволяют отслеживать состояние клеток организмов уже на ранних этапах воздействия внешних факторов, регистрировать начальные нарушения клеточного метаболизма.

На молекулярном уровне индикации используются показатели ряда биохимических реакций и содержания внутриклеточных продуктов, которые наиболее чувствительны к воздействию загрязнений и других неблагоприятных факторов и которые относительно легко диагностировать.

Информативным показателем является внутриклеточное содержание ATP. В норме содержание ATP составляет около 2 мг/г сухой массы клеток и быстро уменьшается при снижении доступности субстрата или введении токсичного субстрата. При мгновенной гибели клеток наблюдается полная потеря ATP в результате автолиза. Время оборота для ATP составляет около 1 с.

Наряду с измерением ATP часто используют тесты на дегидрогеназную активность, активность -глюкозидазы, протеазы, -ацетилглюкоаминидазы, фосфатазы, фосфодиэстеразы и других ферментов, перекисное окисление липидов липосом (по образованию малонового диальдегида в тестируемой и контрольной пробах), мембраноповреждающее действие, пролиферацию пероксисом (в тканях животных), методы с молекулярными зондами и др. Некоторые из этих методов приняты в качестве стандартных в России и отражены в соответствующих официальных документах.

Для регистрации изменений на клеточном и молекулярном уровнях под воздействием антропогенных факторов получили развитие различные спектральные и люминесцентные методы, а также ПЦР-анализ, которые используются для диагностики состояния клеток микроорганизмов, микроводорослей, растений, животных.

У растений и водорослей загрязнения в первую очередь влияют на фотосинтетический аппарат. В присутствии загрязнений наблюдается уменьшение содержания хлорофилла в мембранах хлоропластов растений, или снижение способности фитопланктона к продуцированию кислорода в процессе фотосинтеза. Характер изменения первичных стадий фотосинтеза отражается в изменении флуоресценции хлорофилла в фотосинтетических мембранах клеток, что может быть измерено люминометрами и флуориметрами. Люминесцентные методы диагностики применимы для исследования флуоресценции фитоплан-

ктона в природных водоемах. С помощью флуоресцентного микроскопа можно определять гетерогенность популяции в целом.

Для измерения содержания токсикантов большое распространение получил метод с измерением бактериальной люминесценции. В этом методе используются бактерии-биосенсоры, содержащие lux-гены, отвечающие за синтез бактериальной люциферазы – фермента, катализирующего ATP-зависимую люциферин-люциферазную реакцию, сопровождающуюся свечением. Количественное определение испускаемой биолюминесценции может быть легко записано люминометром и сравнено с внутренней калибровкой, полученной для известных концентраций загрязнений. Присутствие токсичных веществ приводит к ингибированию активности бактерий и люциферазы, что сопровождается снижением интенсивности (гашению) люминесценции. Отклик люминесцентных бактерий на токсические вещества полностью коррелирует с таковым у других биологических организмов, и величина 50%-го тушения свечения ЕС50 коррелирует с величиной ЛД50 (см. разд. 11.2) для высших животных и человека,

атакже с другими биосенсорами.

Влюминесцентных биосенсорах обычно используются морская светящаяся бактерия Vibrio fischeri. Однако методика определения с этой бактерией требует определенных pH и использования буферных растворов, что может изменить форму нахождения загрязнения в анализируемом образце. Кроме того, в данном тесте используется морская бактерия, что может неадекватно отражать реакцию наземных организмов на поллютант. Поэтому были разработаны биосенсорные системы с lux-генами и более сложными генетическими конструкциями (например, содержащими lux-гены и гены устойчивости к загрязнениям), интегрированными в более подходящие по экологическим свойствам тест-организмы: Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens, P. putida, Rhizobium leguminosarum, Ralstonia metallidurans CH34, Photobacterium phosphoreum и позволяющими, в частности, определять биодоступность загрязнений в водных растворах, почвенных вытяжках. Такие микробные биосенсоры обладают большей чувствительностью, чем ферментные системы на основе люциферазы или методы с измерением ингибирования дыхательной активности или скорости роста. Тесты с их использованием простые и быстрые и эффективны при первичном скрининге токсичности и биодоступности субстрата, при мониторинге популяций микроорганизмов, содержащих lux-метку, в окружающей среде. Разработаны люминесцентные биосенсоры для обнаружения и определения содержания тяжелых металлов, органических поллютантов, а также содержания ATP. Чувствительность их при определении ATP составляет 10–5–10–7 мг.

Количественный ПЦР-анализ может быть использован для прослеживания бактериальных популяций в почве, для идентификации штаммов-биодеструк- торов, оценки генетического потенциала и разнообразия сообщества микроорганизмов в почвенных, водных и других средах, для оценки токсичного и мутагенного действия супертоксикантов и их действия на изменения функциональных свойств почвенных и водных сред. Анализируется тотальный пул ДНК, плазмидный состав микробных консорциумов и т. д. Это позволяет получить

необходимые данные для оценки биоразнообразия, вероятности распространения рекомбинантных штаммов в природных экосистемах, в том числе оценить последствия их применения на практике.

Виммуноферментных методах анализа (ИФА) в качестве специфического детектора определяемого вещества выступает антитело, а в качестве маркера иммунохимической реакции, с помощью которого визуализируется образование комплекса, выступает фермент. Методы ИФА подразделяются на твердофазные (ELISA – enzyme linked immunosorbent assay, EMIT – enzyme multiply immunotechnic)

игомогенные.

Вметоде ELISA используется принцип иммобилизации одного из компонентов (антигена Ag или антитела Ab) на носителе. Определяемое вещество (антитело или антиген) соответственно конкурирует с аналогичными веществами, в которые введен фермент-маркер, за связывание на сорбенте:

После удаления непрореагировавших веществ определяется концентрация фермента, связавшегося с сорбентом. В качестве ферментов-маркеров используется пероксидаза, -галактозидаза, щелочная фосфатаза, глюкозооксидаза и др. Методы ELISA широко используются в диагностике инфекционных заболеваний человека, животных, растений.

Методы EMIT разработаны для определения низкомолекулярных соединений – гаптенов, лекарств, гормонов, физиологически активных соединений. Сущность метода – гаптен пришивается ковалентно, вблизи активного центра фермента таким образом, что после его взаимодействия с антителом молекула фермента теряет свою каталитическую активность. Добавление в эту систему свободного гаптена приводит к пропорциональному увеличению активности фермента из-за вытеснения антител из комплекса.

Вкачестве ферментов в таких системах используются лизоцим, малатдегидрогеназа, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа. Методы просты и быстры. Время анализа занимает несколько минут. С их помощью определяют гормоны, наркотики, барбитураты, антиэпилептические средства.

Вметоде ЛИКА используется гомогенный анализ на основе биолюминесценции. В качестве маркера применяется молекула ATP, пришитая к инсулину. Добавление антител против инсулина приводит к экранированию молекулы ATP и ее недоступности для светлячковой люциферазы. Чувствительность методов ИФА до 10–14 М.

Получение антител, специфичных к различным токсинам микроорганизмов, пестицидам, поли- и нитроароматическим соединениям, диоксинам и фуранам, хлорированным бифенилам, пентахлорфенолам, автомобильному топливу, ртути и другим загрязнениям, способствовало применению методов иммуноферментного анализа в экологическом мониторинге.