Кузнецов А.Е., Градова Н.Б., Лушников С.В. и др. Прикладная экобиотехнология. Учебное пособие. В 2-х томах

Нитрагин – биологическое удобрение на основе клубеньковых бактерий р. Rhizobium. В России было разработано производство почвенного и сухого нитрагина.

Почвенный нитрагин – культура клубеньковых бактерий, выращенная в стерильной почве. 1 г такого препарата содержит не менее 0,3 млрд жизнеспособных клеток.

Сухой нитрагин (ризобин) – порошок с титром >9 млрд жизнеспособных бактерий на 1 г препарата в смеси с наполнителем (бентонитом, каолином, мелом). Технология его получения предусматривает глубинное культивирование ризобий с последующим выделением клеток, смешением с защитной средой и сушкой (рис. 4.37). Узкое место технологии – стадия сушки, поскольку ризобии весьма чувствительны к нагреву и дефициту влаги.

Препараты нитрагина применяют совместно с фосфорно-калиевыми и органическими удобрениями, которые повышают активность клубеньковых бактерий.

Ризоторфин – более эффективный по сравнению с нитрагином препарат, технология получения которого была разработана в 1973–1977 гг. (рис. 4.38). Содержит клубеньковые бактерии р. Rhizobium на торфе.

Торф является наиболее подходящим субстратом-носителем по влагоемкости, удельной поверхности, содержанию органического вещества, доступности

истоимости. Однако это нестандартный носитель, который часто содержит токсичные для клубеньковых бактерий вещества. В технологии производства ризоторфина используется низкосолевой кислый или слабокислый торф (pH 3,0–6,0). Торф подсушивается до влажности 25–30% и размалывается до среднего размера частиц <0,1 мм. Этим достигается хорошая прилипаемость препарата к инокулированным семенам. Для повышения прилипаемости в торф могут добавлять водорастворимый клей, например карбоксиметилцеллюлозу. Добавки мела обеспечивают нейтральный pH.

Втехнологии используется радиационная стерилизация торфа, поскольку тепловая стерилизация неэффективна из-за низкой теплопроводности торфа

ивозможности накопления токсичных веществ при тепловой обработке. Выращивание ризобактерий проводят на отваре гороха, фасоли, люпина

с добавками сахарозы, глюкозы или маннита и минеральных солей. Полученной суспензией с помощью инъекционной иглы под давлением инокулируют пакеты с подготовленным торфом в стерильных условиях до конечной влажности 45–55%. Перед инокуляцией в жидкую культуру вносят стерильные растворы углеводов (мелассы, декстрина, молочной сыворотки) в количестве до 3% к массе сухого торфа.

Рис. 4.37. Блок-схема технологии получения сухого нитрагина

Инокулированные пакеты загружаются во вращающийся барабан на 3–5 мин для перемешивания содержимого пакета. При необходимости быстрого получения готового препарата инокулированные пакеты после перемешивания их содержимого помещают на 4–6 сут в термостат при температуре 20–21 °С или на 3 сут при 28 °С. В последующем рост ризобактерий продолжается еще около 5 недель при 20 °С. За это время численность жизнеспособных клеток увеличивается в 2–5 раз. Медленно растущие культуры бактерий хранят при температуре 12–15 °С, быстрорастущие культуры – при 5–10 °С. Через 2 года хранения препарата при 5 °С жизнеспособность клеток составляет 10% от первоначальной. При хранении при 25 °С уменьшение жизнеспособности клеток до 10% от первоначальной происходит через 8 недель.

Препараты «Нитрагин» и «Ризоторфин» используют совместно с высевом зернобобовых культур.

Для улучшения доступа фосфора к растениям в качестве биоудобрений используют препараты на основе бактерий и на основе грибов.

Бактериальный препарат фосфобактерин содержит бактерии Bacillus megaterium var. phosphaticum, обладающие способностью превращать сложные фосфорсодержащие органические соединения (нуклеиновые кислоты и др.) и трудноусвояемые минеральные фосфаты (трехосновные фосфаты железа, алюминия и кальция, пирофосфаты, полифосфаты) в доступную для растений форму. Кроме того, бактерии вырабатывают биологически активные вещества (тиамин, биотин и другие витамины), стимулирующие рост растений. Препарат не заменяет фосфорные удобрения и не действует без них.

Технология получения фосфобактерина включает стадии выращивания микробных клеток и спор, их выделения из ферментационной среды, сушки (рис. 4.39).

Рис. 4.38. Блок-схема технологии получения ризоторфина

Из препаратов эндомикоризных грибов наиболее эффективны грибы – симбионты растений, образующие везикулярно-арбускулярную микоризу.

Одни грибы в результате размножения образуют вокруг мелких корешков чехол – эктомикоризу. Другие, проникая в кортикальную ткань корней, образуют эндомикоризу. В результате проникновения устанавливаются симбиотические отношения, выгодные растениям-хозяевам. Две из трех известных разновидностей эндомикоризы встречаются только в пределах семейств Ericaceae и Orchidaceae. Третья из них, известная под названием «везикулярноарбускулярная микориза» (ВА-микориза), особенно важна для сельского хозяйства. ВА-микориза найдена у большинства важнейших видов сельскохозяйственных растений. Микориза ВА, образуемая грибом-фикомицетом из семейства Endogonaceae, встречается особенно часто в большинстве почв всех климатических зон.

Рис. 4.39. Блок-схема технологии получения фосфобактерина

ВА-микориза помогает растениям поглощать из почвы фосфаты. Фосфатионы в почве малоподвижны и поэтому вокруг корней их часто недостает. Гифы микоризы, вырастающие из корневого мицелия и распространяющиеся за пределы области дефицита фосфата, переносят его непосредственно в клетки рас- тения-хозяина. При этом также увеличивается поступление микроэлементов. ВА-микориза повышает концентрацию гормонов роста в растениях, усиливает образование клубеньков и азотфиксацию. Особенно часто необходимость внесения в почву грибного мицелия и спор, вызывающих образование ВА-микори- зы, возникает на стерилизованных почвах.

Как биологический препарат используют инокулят ВА-микоризы – растения с ВА-микоризой или же инфицированную почву. При этом у растениядонора и растения-хозяина, для которого предназначен вырабатываемый инокулят, не должно быть общих заболеваний корневой системы. Использование мицелия гриба без растения-хозяина позволило бы избежать опасности заболевания, однако проблема получения мицелия гриба без растения-хозяина еще не решена.

Биопрепараты на основе эндомикоризных грибов эффективны при биологической рекультивации земель с целью не только увеличения доступности фосфора и микроэлементов растениям, но и повышения стрессоустойчивости растений, при восстановлении сульфидсодержащих грунтов. Для этих целей возможно и совместное использование фосфатмобилизующих бактерий и эндомикоризных грибов.

Современные биопрепараты, предназначенные для рекультивации территорий и восстановления плодородия почв, возврата их в хозяйственное пользование, создаются на основе методов биотехнологии, скрининга и селекции высокоактивных штаммов почвенных микроорганизмов. Такие биопрепараты могут включать сообщество полезной почвенной микрофлоры, характерное для местных условий, микроорганизмы-аддитивы, повышающие активность основной микробной составляющей препарата, обладающие фунгицидной и инсектицид-

ной, гидролитической (целлюлолитической, лигнолитической, протеолитической) активностями, гуминовые вещества, сорбенты и другие добавки, повышающие жизнеспособность микроорганизмов, их активность, стимулирующие и регулирующие развитие растений, расширяющие спектр действия препаратов. Они экологически безопасны, имеют относительно невысокую стоимость, позволяют снижать расходы органических удобрений и мелиорантов. Технология их получения типична для биотехнологического производства и хорошо отработана.

Ряд биопрепаратов для рекультивации содержит микроорганизмы-азотфик- саторы рр. Azotobacter, Azospirillum. Некоторые штаммы этих бактерий способны к кометаболизму и биодеструкции таких загрязнений, как углеводороды нефти, используя для этого корневые выделения растений. Они синтезируют полисахариды и другие вещества, что важно для структурирования почвы и задержания влаги, обогащения почвы гуминовыми кислотами. Синтез повышенных количеств витаминов, гормонов, аминокислот стимулирует развитие растений. Пример такой разработки – препарат «Риазофилл». Он разработан совместно Институтом микробиологии РАН и Институтом физиологии растений РАН и включает азотфиксирующие клубеньковые бактерии (ризобии) и азоспириллы. По эффективности действия Риазофилл превосходит однокомпонентный препарат Нитрагин.

Среди PGPR различных таксономических групп широким набором полезных для растений свойств обладают бактерии р. Pseudomonas: ряд штаммов

Pseudomonas putida, P. fluorescens, P. aureofaciens и другие. Некоторые из них стимулируют рост растений в результате синтеза бактериями различных метаболитов, полезных для растений, регуляторов роста (индолилуксусной кислоты, гиббереллиноподобных веществ), другие вытесняют и подавляют развитие почвенных фитопатогенов или микроорганизмов, угнетающих рост растений, индуцируют у растений устойчивость к фитопатогенам, третьи способны улучшать фосфорное питание растений, фиксировать атмосферный азот. Псевдомонады холодоустойчивы, для штаммов-азотфиксаторов оптимальная температура для азотфиксации 14–20 °С. В то же время для процесса азотфиксации других ассоциативных диазотрофов, например, бактерий р. Azospirillum, оптимальной температурой является 25 °С. На основе различных штаммов псевдомонад в настоящее время разрабатываются биологические средства защиты растений от фитопатогенов, биопрепараты, стимулирующие продуктивность растений.

Разработанный в НИИ экологии топливно-энергетического комплекса (г. Пермь) препарат «БИОР-АБ» получают на основе бурого угля. Он содержит азотфиксирующие и фосфатрастворяющие бактерии, ряд витаминов, органических кислот и биогенных элементов и рекомендуется для рекультивации шахтных отвалов, утилизации твердых отходов угольной промышленности. При применении данных препаратов растительный покров и дерновый слой восстанавливаются в течение 2–3 лет.

В НПО «Биотехнология» разработан ряд препаратов: «Азотовит», «Бактофосфин» и другие, стимулирующих рост растений, развитие почвенной микрофлоры, прорастание семян, фотосинтез, разложение стерни. Препарат «Азо-

товит» создан на основе ассоциативных азотфиксаторов. Препарат обогащает почву биологическим азотом, нормализует питание растений, повышает устойчивость растений к заболеваниям. Микроорганизмы, входящие в состав биопрепарата, продуцируют антибиотические вещества, подавляющие развитие в почве фитопатогенных микроорганизмов.

Фосфорное удобрение «Бактофосфин» повышает урожайность сельскохозяйственных культур в результате мобилизации нерастворимых соединений фосфора в почве, устойчивость растений к грибным заболеваниям, позволяет сократить расход фосфорных минеральных удобрений в 2 раза и более, восстановить биологическую активность почв в районе применения.

Препараты-биоактиваторы для растениеводства относятся к биологическим регуляторам, стимуляторам роста растений. Они стимулируют прорастание семян, развитие ризосферной микрофлоры, активируют фотосинтез, разложение пожнивных остатков, процесс формирования гумуса. Основу препаратов составляют регуляторы роста растений (фитогормоны гетероауксины, цитокинины, гиббереллины), другие биологически активные вещества, ассоциативные культуры бактерий – естественных обитателей прикорневой зоны растений, синтезирующих фитогормоны. Препараты также содержат микроэлементы, необходимые для питания растений.

4.6.Сравнение методов ремедиации

Эффективность использования тех или иных методов ремедиации определяется прежде всего целями и задачами очистки и зависит от многих локальных факторов: почвенно-климатических условий, физико-химических свойств очищаемой среды, характера и уровня загрязнений, уровня технических и са- нитарно-гигиенических требований к ремедиационным работам, формой хозяйственного использования земли после ремедиационных работ, необходимых сроков их выполнения, имеющихся технологических и технических возможностей, финансовых, экологических ограничений, отношений с административными органами и других факторов.

Если объем или территория загрязненной зоны небольшие, обычно используются методы ex situ или on site, за исключением случаев, когда изъятие загрязненного материала технически невозможно, например, на застроенных участках. Эти методы обеспечивают возможность создания оптимальных условий для очистки и ускоряют ремедиацию, однако требуют дополнительных затрат на сбор, складирование и обработку материала.

Использование способов очистки in situ наиболее эффективно, если загрязнение летучее, растворимо в воде и/или биодоступно, расположено в глубинных почвенных горизонтах, под зонами застройки или на большой территории, и почвы имеют высокую проницаемость и гомогенность. В ряде случаев методы in situ позволяют продолжать использование территории, содержащей загрязненные зоны, непосредственно в ходе ремедиационных мероприятий. Методы in situ сложно применять для очистки почв от биологически стойких, нелетучих и

нерастворимых соединений, какими являются, например, бензпирены и полихлорированные бифенилы, тяжелые металлы и радионуклиды.

При in situ очистке загрязненных почв возможны объемный, поверхностный и линейный подходы к проведению работ.

При объемном подходе целью ремедиации является удаление всей массы загрязнения из среды. Этот метод применим к участкам с небольшим количеством загрязнений, расположенным, например, в районах застройки, селитебных зон, автозаправочных станций, нефтебаз и др., и выполняется в относительно короткие сроки.

При поверхностном подходе решается задача предотвратить распространение загрязнения в вертикальном направлении, например, в водоносные горизонты или проникновение паров летучего загрязнения в жилые здания.

Основная цель при линейном подходе – предотвращение горизонтального распространения загрязнения. Ремедиационные средства монтируются в направлении вертикальной оси или плоскости, например, для извлечения загрязненных грунтовых вод через скважины или ряд вертикальных колодцев. Другим примером является сооружение биобарьера (биоэкрана) в вертикальной плоскости для биодеградации органических соединений или обездвиживания тяжелых металлов, мигрирующих через барьер.

Если время, в течение которого загрязнение должно быть удалено или нейтрализовано, не является решающим фактором, то могут быть использованы менее затратные экстенсивные методы очистки, в частности метод самоочищения (природного истощения). В этом случае задача ремедиационных мероприятий сводится к контролю за распространением загрязнений. Однако при высоких концентрациях загрязнений и их опасности для окружающей среды и человека применение методов самоочищения неприемлемо.

Интенсивными методами удаления загрязнений являются конвективный транспорт и биодеградация. Выбор наиболее эффективного метода определяется свойствами загрязнения, глубиной его проникновения, уровнем грунтовых вод. Если загрязнение летуче и находится выше грунтовых вод, то наиболее подходящим является метод экстракции почвенных газов. Если загрязнение нелетуче, водорастворимо и биоустойчиво, то лучшие результаты дает использование метода промывки. При наличии загрязнений ниже верхнего уровня грунтовых вод целесообразнее использовать метод промывки и метод барботирования в сочетании с методом экстракции почвенных газов. Недостатком таких интенсивных вариантов ремедиации является необходимость последующей очистки извлекаемых почвенных газов и вод, в то время как при экстенсивном методе бо‚льшая часть присутствующих в них загрязнений обезвреживается в результате естественных процессов самоочищения, поэтому стоимость очистки ниже интенсивных методов.

Небиологические методы ремедиации считаются более надежными по сравнению с методами биоремедиации (табл. 4.8, 4.9). Эффективность небиологических методов, как правило, мало зависит от характеристик загрязнений почвы и воды и практически не зависит от климатических условий места расположения загрязненного объекта. Ремедиационные работы при использовании физико-

химических или химических методов могут длиться от нескольких дней до нескольких недель (в зависимости от масштаба проекта), процессы биоремедиации могут продолжаться от нескольких месяцев до нескольких лет.

Основными преимуществами биологических методов являются протекание процесса очистки в относительно мягких условиях, не изменяющих качество окружающей среды, значительно меньшие затраты на ее осуществление, высокая эффективность очистки. Стоимость биоремедиации (в условиях США) на 10–40% ниже, чем цена аналогичного проекта, выполненного при использовании физико-химических методов.