Кузнецов А.Е., Градова Н.Б., Лушников С.В. и др. Прикладная экобиотехнология. Учебное пособие. В 2-х томах

Вразличных странах в качестве сырья для производства биоэтанола используются кукуруза, пшеница, тропические культуры (сахарный тростник, маниок

идр). Благоприятные климатические условия способствуют получению высоких урожаев, а дефицит нефти формирует рыночный спрос на биоэтанол.

Первой страной, начавшей крупномасштабное производство этанола как автомобильного горючего, стала Бразилия. Этанол производится из сахарного тростника. Относительно невысокая рыночная стоимость сахарного тростника, использование тростникового жома в качестве топлива на самих предприятиях по получению этанола и высокая стоимость нефти позволяют конкурировать биоэтанолу с бензином. В настоящее время существенная часть возделываемых земель в этой стране занята сахарным тростником, выращиваемым с целью получения спирта.

Биоэтанол из кукурузы в больших количествах производится в США, где периодически образуются огромные излишки кукурузы, и получение из нее этанола помогает решить проблему реализации урожая и снизить зависимость от импорта нефти. Для стимулирования использования этанола в качестве моторного топлива введены налоговые льготы, которые компенсируют продавцам убыток в случае, если они продают этанол по цене бензина. «Энергетический Билль», принятый в США, законодательно требует использования 23 млн т биотоплива (в основном биоэтанола и биодизеля) в 2012 г. и 108 млн т биотоплива к 2022 г.

Встранах Евросоюза доля топлива из возобновляемых источников, в первую очередь, биоэтанола, составляет не менее 5,75%.

По прогнозу международной энергетической ассоциации, мировое производство биоэтанола в 2020 г. достигнет около 100 млн т в нефтяном эквиваленте. Международная ассоциация воздушного транспорта планирует заменить до четверти потребления нефтяного топлива самолетами на биотопливо или синтетическое топливо к 2015 г., и на треть – к 2030 г.

Отпускная цена биоэтанола в Бразилии в 2006 г. составляла 27 центов/л, в США – 2,25 долл./л.

ВРоссии технический этанол производят из гидролизатов древесины. Гидролизаты древесины получают в результате перколяционного гидролиза растительного сырья (древесных опилок, щепы, отходов сельского хозяйства: рисовой шелухи, подсолнечной лузги, обмолоченных стержней початков кукурузы) в условиях высокой температуры (160–200 °С) при давлении 2–4 атм в присутствии разбавленной серной кислоты. В этих условиях растительные полимеры целлюлоза и гемицеллюлоза расщепляются с образованием моносахаров (гексоз и пентоз), которые переходят в гидролизаты. Лигнин – другой полимерный компонент, входящий в состав растительной массы и импрегнирующий целлюлозу и гемицеллюлозу, не гидролизуется и остается в качестве отхода. Часть из содержащихся в гидролизатах сахаров (гексозы) может сбраживаться дрожжами в этанол. Несброженные

С5-сахара и уроновые кислоты, остающиеся после отгонки спирта, утилизируются с получением кормовых дрожжей (выход биомассы дрожжей из 1 т древесины 40 кг).

В бывшем СССР, в основном с середины 1930-х до середины 1970-х гг., было построено несколько десятков гидролизных и гидролизно-дрожжевых заводов (профиль заводов определяется составом сырья), на которых получали технический этанол, кормовые дрожжи, жидкий и твердый диоксид углерода (сухой лед), фурфурол, ксилит и некоторые другие продукты. Преимущество этого способа получения этанола в том, что не используется пищевое сырье (зерно). Из 1 т древесины хвойных пород можно получить до 170–180 л этанола при выходе спирта 48% от сбраживаемых сахаров, содержащихся в гидролизатах. Из 1 т древесины лиственных пород – меньше, поскольку содержание сбраживаемых сахаров в ней ниже.

Гидролизат древесины, получаемый высокотемпературным перколяционным гидролизом, – субстрат недоброкачественный. Он содержит много веществ, образующихся при высокой температуре и угнетающих развитие микроорганизмов, поэтому в промышленных масштабах его используют лишь для получения продуктов брожения (прежде всего этанола) и кормовых дрожжей. В технологическом процессе не удается перерабатывать гидролизаты с высоким содержанием сахаров. Подаваемое на ферментацию сусло должно содержать не более 3–4% сахаров, поэтому после брожения оно содержит не более 1,5–2% этанола, и затраты на отгонку и ректификацию спирта велики. При отгонке 10%-го раствора этанола расход пара составляет 2,25 кг на 1 л получаемого 96%-го спирта, а при отгонке 2%-го – увеличивается уже до 10 кг.

Другим недостатком гидролизных заводов является высокая капиталоемкость (табл. 3.23) – для проведения гидролиза растительного сырья требуются дорогостоящие гидролизно-перколяционные аппараты, системы очистки гидролизатов, подготовки их для ферментации. Кроме того, это производство экологически ущербное, поскольку при получении гидролизатов в качестве твердого отхода образуется большое количество гидролизного лигнина, проблема утилизации которого до сих пор не решена, тратятся большие объемы технологической воды.

По этим причинам до последнего времени получение этанола из гидролизатов древесины оставалось в целом экономически и экологически неэффективным, низкорентабельным, а иногда и убыточным. Гидролизные заводы были построены лишь в СССР и несколько заводов – в КНДР и КНР (с помощью Советского Союза).

Низкое содержание этанола в сброженном сырье ограничивает возможности получения его из таких отходов, как, например, нативная молочная сыворотка. Технологии переработки сыворотки в этанол существуют, но сброженная сыворотка содержит лишь 1,5–2,5% этанола, и себестоимость спирта-ректификата высока. Тем не менее в комплексе с решением экологических проблем, обусловленных сбросом неутилизированной молочной сыворотки в водоемы, этот вариант получения этанола может найти практическое применение.

Таблица 3.23.

Типичная структура затрат на производство этанола на зерно-спиртовых заводах (по состоянию на 2005 г.), гидролизных заводах (по состоянию на 1980-е гг.) и н-бутанола (по состоянию на 1980-е гг.)

Другое сырье – зерно и картофель, в меньшей степени меласса — также используются для производства пищевого этанола. Из 1 т картофеля можно получить до 100 л этанола, а из 1 т ячменя, пшеницы или ржи – 260–300 л этанола. При этих вариантах в сброженном сусле содержание этанола составляет 7–8% и затраты на отгонку относительно небольшие. Но пищевое сырье дорогое, доля его в себестоимости продукции достигает 60–70% (табл. 3.23). Кроме того, в зерно-спиртовом и картофеле-спиртовом производствах образуется большое количество барды – жидкого отхода, остающегося после отгонки спирта. При себестоимости спирта на российских заводах 14–18 руб./л (средняя стоимость зерносырья около 2200 руб./т) отпускная цена 1 л этанола при его получении из фуражного зерна составляла 18 руб. (по состоянию на 2006 г.).

До последнего времени в России этанол, получаемый из гидролизатов древесины, зерна или картофеля, в качестве топлива практически не использовался. Для масштабного производства топливного этанола из биомассы необходимо решить несколько проблем: обеспечить это производство сырьем, содержащим нужное количество сбраживаемых углеводов, получаемым дешевым способом и при малых энергозатратах; повысить конечный уровень накопления спирта в ферментационной среде для уменьшения затрат на отгонку спирта. Желательно при этом не использовать сырье пищевого и кормового назначения. Само производство биоэтанола должно быть экологически чистым, чтобы степень утилизации отходов была высокой, поступление загрязнений в окружающую

404 Глава 3

среду при получении биоэтанола не перекрывало положительный экологический эффект при его использовании в качестве топлива. Энергетические затраты на получение спирта должны быть существенно ниже энергии, содержащейся в самом спирте (коэффициент EROEI – energy returned on energy invested должен быть существенно выше 1).

Для снижения себестоимости топливного этанола разрабатывается ряд вариантов совершенствования биотехнологии его получения.

На российских предприятиях при получении спирта по классической технологии в качестве штаммов-продуцентов используются в основном дрожжи

Schizosaccharomyces pombe (на гидролизатах древесины), Saccharomyces cerevisiae

(при использовании в качестве сырья зерна или картофеля), иногда S. uvarum (carlsbergensis) и S. diastaticus. Оптимальная температура для их роста и процесса брожения 25–33 °С, pH 4–5; при этом значении pH уменьшается опасность бактериальной контаминации, отрицательно влияющей на спиртовое брожение. Обычная продуктивность реактора при брожении в периодических условиях 1–2 г этанола/(ч·г СВ). На предприятиях ферментацию ведут в непрерывных условиях, а продуктивность реактора увеличивают путем возврата на ферментацию дрожжевой биомассы, сгущенной с помощью сепаратора.

Недостатки штаммов-сахаромицетов и шизосахаромицетов:

относятся к факультативным анаэробам, у которых наблюдается конкуренция между брожением и дыханием в микроаэрофильных и аэробных условиях, поэтому необходимо вести процесс в анаэробных условиях или использовать мутанты, утратившие митохондрии и неспособные к дыханию;

чувствительны к этанолу в концентрации 8–10% и выше. Устойчивые мутанты характеризуются измененным строением клеточных мембран; отсутствие ферментов, катализирующих расщепление крахмала, целлюлозы, ксилана, поэтому требуется проводить предгидролиз субстрата

или использовать смешанную культуру микроорганизмов; не сбраживают С5-сахара и не утилизируют уроновые кислоты и феноль-

ные соединения, которые есть в гидролизатах.

Повысить скорость спиртового брожения и выход спирта можно с помощью бактерий, термофильных микроорганизмов, микроорганизмов, способных одновременно гидролизовать растительные полимеры и сбраживать сахара, микроорганизмов, устойчивых к высоким концентрациям этанола, а также сбраживающих пентозы.

Более эффективно сбраживают сахара и более устойчивы к этанолу бактерии Zymomonas mobilis. Этот вид обладает большей скоростью роста и образования этанола, чем дрожжи Saccharomyces сerevisiae, сохраняет жизнеспособность при объемной доле этанола в среде 14%. Удельная продуктивность биореактора с этими бактериями в режиме периодического культивирования составляет 2,5–3,8 г этанола/(ч·г СВ). Бактерии Z. mobilis разлагают углеводы через 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатный путь. Пируват, так же как и у дрожжей, является промежуточным продуктом, который декарбоксилируется в ацетальдегид, а затем восстанавливается в этанол; при этом из 1 моль глюкозы обра-

зуется 2 моль спирта. По сравнению с дрожжами количество синтезируемого АТФ у бактерий в два раза меньше. Это приводит к тому, что бактерии на 1 моль превращенной глюкозы синтезируют вдвое меньше биомассы, чем дрожжи, а выход этанола при этом увеличивается примерно на 5%. Сравнительная характеристика бродильных свойств свободных клеток дрожжей S. carlsbergensis и бактерий Z. mobilis приведена в табл. 3.24.

Таблица 3.24.

Сравнительная характеристика бродильных свойств дрожжей S. carlsbergensis и бактерий Z. mobilis

Существенным недостатком бактерий Z. mobilis является узкий спектр утилизируемых субстратов, ограничивающийся глюкозой, фруктозой и сахарозой. Наличие у Z. mobilis множественной резистентности к антибиотикам создает определенные трудности при генетическом конструировании штаммов для расширения спектра утилизируемых субстратов.

Активными продуцентами этилового спирта являются также термофильные бактерии рр. Clostridium и Thermoanaerobacter. Термофильные бактерии C. thermocellum способны одновременно осуществлять и гидролиз растительных полимеров, и ферментацию до этанола. У термофилов наблюдается высокая скорость роста и метаболизма, стабильные ферменты. Культивирование их проводится при повышенных температурах, в результате чего растворимость кислорода и других газов уменьшается и в среде создаются более анаэробные условия, способствующие брожению. С увеличением температуры уменьшается вязкость среды, повышается летучесть этанола, что приводит к уменьшению затрат энергии при его дальнейшем выделении. Термофильные бактерии синтезируют меньше биомассы, чем дрожжи, что обусловлено увеличением метаболических затрат на поддержание жизнедеятельности термофилов при повышении температуры и, как следствие, ведет к увеличению выхода спирта. Однако термофилы весьма чувствительны к этанолу (ингибирующие концентрации 0,5% и выше), что не позволяет пока разработать эффективный термофильный процесс получения этанола.

Еще одним приемом интенсификации биосинтеза этанола является создание генетически измененных штаммов спиртообразующих дрожжей и бактерий. В настоящее время работы в области генетической трансформации спиртообразующих микроорганизмов ведутся в двух направлениях: создание штаммов, способных сбраживать несвойственные им сахара, и создание штаммов спиртообразующих дрожжей, обладающих амилолитической активностью, необходимой для расщепления крахмала.

Найдены виды дрожжей, способные осуществлять ферментацию пентоз, но они чувствительны к спирту. Порог этой чувствительности может быть изменен генетическими методами; кроме того, путем клонирования гена ксилозоизомеразы дрожжам рода Saccharomyces может быть передана способность потреблять ксилозу. Это позволит им осуществлять конверсию ксилозы (субстрата, на котором они не растут) в ксилулозу (субстрат, который они сбраживают).

Амилолитические ферменты, продуцируемые спиртовыми штаммами дрожжей, должны удовлетворять следующим технологическим требованиям: белки — секретироваться во внеклеточную среду, а не оставаться связанными с клеточной стенкой дрожжей; оптимум рН ферментов должен находиться в пределах 3,5–5,5; температурный оптимум — быть в интервале от 35 до 45 °С; ферменты — обладать высокой удельной активностью. Проблема создания штамма спиртообразующих дрожжей, обладающего амилолитической активностью, может быть решена путем передачи генов глюкоамилазы дрожжам Saccharomyces diastaticus методом гибридизации или введением генов амилолитических ферментов!амилазы и глюкоамилазы. Однако, несмотря на значительные усилия, предпринимаемые исследователями, до настоящего времени нет данных об использовании мутантов, полученных путем генетической трансформации, в качестве продуцентов этилового спирта в промышленных условиях.

Возможно также использование ацидофильных (оптимум pH 1,5) и галофильных продуцентов спирта, а также смешанных культур микроорганизмов, способных осуществлять прямую биоконверсию крахмалсодержащих отходов в этанол.

Резко увеличить скорость спиртового брожения можно путем иммобилизации клеток микроорганизмов-продуцентов. При иммобилизации активность клеток стабилизируется, а субстрат не тратится на накопление биомассы, поэтому выход спирта повышается.

Для промышленных технологий на основе свободных клеток дрожжей продуктивность реактора по этанолу составляет 10 г/(л·ч), время полного сбраживания около 5–6 ч при исходной концентрации сахаров 5–10%. При использовании иммобилизованных клеток дрожжей эти показатели повышаются соответственно до 50 г/(л·ч) и 15–30%, а при использовании бактерий продуктивность увеличивается до 100 г/(л·ч), хотя концентрация сахаров не превышает 15%.

Для иммобилизации используют щепу, пористую керамику, силикагель, Сa-альгинат с частицами кремния, Al-альгинат, каррагинан, полиакриламид, криогель поливинилового спирта, фотосшитые полимеры. Среди фотосшитых полимеров наиболее перспективны носители на основе полиэтиленгликоля, размеры частиц которых можно легко изменять, варьируя степень полимеризации.

В табл. 3.25 представлены сравнительные характеристики этанольного брожения иммобилизованными клетками дрожжей и бактерий при разных способах иммобилизации и типах аппаратов.

Таблица 3.25.

Влияние способа иммобилизации клеток на конверсию углеродсодержащего субстрата в этиловый спирт (по А .П. Синицыну и др., 1994; кн. Иммобилизованные клетки и ферменты, 1988)

Клетки Saccharomyces cerevisiae, иммобилизация адсорбцией

Недостатком способов иммобилизации является необходимость регенерации носителя, обусловленная наличием смолистых и красящих веществ в перерабатываемом сырье, что затрудняет процесс ферментации в промышленных условиях.

Одним из способов иммобилизации, лишенных указанного недостатка

иобеспечивающих создание системы с высокой концентрацией биомассы, является иммобилизация на поверхности раздела фаз газ—жидкость. Этот способ основан на способности ряда микроорганизмов к флотации, т. е. к закреплению их клеток на поверхности раздела фаз газ—жидкость. Ферментер в этом случае должен работать в газоэмульсионном режиме. Газоэмульсионный режим создается при интенсивном барботаже пенящихся субстратов

ихарактеризуется образованием двухфазной однородной системы, образованной мелкими пузырьками. В нижней части происходит расслаивание газожидкостной эмульсии на пену и жидкость. Дрожжи, закрепленные на поверхности пузырьков, всплывают в активную зону ферментера, а свободную от клеток культуральную жидкость выводят через ложное дно ферментера. Созданные в аппарате условия позволяют удерживать в объеме реактора дрожжи в концентрации 120–160 кг/м3 при скорости разбавления до 1,2 ч–1 без уноса клеток с культуральной жидкостью. При иммобилизации клеток на поверхности раздела фаз газ—жидкость продуктивность реактора по этанолу в 10 раз превышает достигаемую при традиционных способах ведения процесса и в три раза больше продуктивности при использовании дрожжей S. cerevisiae, иммобилизованных на твердом носителе.

Другие способы повышения скорости брожения и выхода этанола основаны на его удалении из ферментационной среды непосредственно во время ферментации (режим in situ). Для этого может быть использована жидкостная экстракция, отвод бесклеточной среды через полупроницаемую мембрану (мембранный биореактор), рециркуляция биомассы дрожжей сепарацией, вакуумная первапорация этанола через селективную мембрану.

Выход этанола из целлюлозосодержащего сырья можно повысить, предобрабатывая сырье различными методами.

При «паровом взрыве» лигноцеллюлоза претерпевает превращения, в результате которых она становится более чувствительной к ферментативному гидролизу. При обработке этим методом умеренно твердых пород древесины образуются отходы, пригодные для дальнейшей переработки микроорганизмами; древесина хвойных и тропических пород, более богатая лигнином, плохо поддается такой обработке.

Другой путь – размол лигноцеллюлозы и ее обработка большими дозами радиации. При этом происходит разрыв химических связей полимеров, и в дальнейшем лигноцеллюлоза легче подвергается деструкции другими методами.

Альтернативой химическому перколяционному гидролизу, а также механическим, физическим и физико-химическим методам предобработки (которые требуют значительных затрат энергии, а также сопровождаются повышенной коррозией материалов, необходимостью нейтрализации стоков, регенерации растворителя и т. д.) является ферментативный гидролиз. Его

проводят в проточных колонных реакторах, в которые загружают целлюлозосодержащее сырье и ферменты или культуральные жидкости целлюлолитических грибов (рр. Trichoderma, Aspergillus и др.). Полученные ферментолизаты содержат значительное количество глюкозы, которая может быть сброжена в этанол. Батарея из 10 реакторов объемом 200 м3 каждый с продуктивностью 5 г/(л·ч) позволяет получить 80 тыс. т сахара в год или 40 млн л спирта в год. К сожалению, несмотря на постоянно снижающуюся стоимость ферментов, ферментативный гидролиз пока еще дороже химического. Для проведения ферментативного гидролиза по разработанным на сегодня технологиям необходимо очищенное сырье, содержащее в основном целлюлозу, свободное от гемицеллюлоз и лигнина (например, газетная бумага, рисовая и пшеничная солома), что ограничивает использование данного метода. Один из вариантов решения этой проблемы – получение высококачественного растительного сырья в результате ферментативной делигнификации (см. раздел 3.2.8), однако эффективная промышленная технология делигнификации древесины пока еще не разработана. Кроме того, делигнифицированное сырье предпочтительнее использовать для производства бумаги, а не биоэтанола. Другой вариант получения целлюлозы может быть основан на создании рекомбинантных фотосинтезирующих микробных продуцентов целлюлозы, в частности цианобактерий, обладающих большим репродукционным потенциалом.

Снижение себестоимости топливного этанола может быть обеспечено при комплексной переработке сырья, при которой в качестве основных и побочных получают товарные продукты с высокой добавленной стоимостью. Например, при переработке зерносырья наряду с этанолом из части сырья можно получать клейковину, крахмал (цена крахмала выше, чем спирта), крахмальные и белковые продукты для пищевых целей, одновременно утилизировать жидкую углекислоту, получать упаренную или обогащенную микробным кормовым белком барду, другие кормопродукты; при переработке сахарной свеклы – этанол, пектин, упаренную барду, кормовые дрожжи, органические кислоты и т. п. По оценкам, такая комплексная технология может повысить рентабельность производства более чем в 2 раза.

Более эффективная предобработка сырья с использованием ферментативного гидролиза и других современных методов, тщательное моделирование процессов и оптимизация условий брожения, внедрение высокопроизводительных биореакторов, энергосберегающих систем отгонки, концентрирования и очистки этанола, комплексная переработка сырья и вторичных ресурсов – дополнительные резервы в совершенствовании биотехнологии получения этанола и снижении его себестоимости.

Еще один вариант биотехнологической переработки биомассы в топливо – конверсия в н-бутанол (биобутанол). Для его получения используется ацетонобутиловое брожение, осуществляемое бактериями Clostridium acetobutylicum. Сырьем для производства биобутанола могут быть сахарный тростник, свекла, кукуруза, пшеница, рожь, маниока, картофель, растительные гидролизаты, отходы, такие как молочная сыворотка.

Вбывшем СССР существовало крупномасштабное производство ацетона

ин-бутанола периодическим, полунепрерывным и непрерывным способами на средах с кукурузной, пшеничной или ржаной мукой, мелассой, гидролизатах растительных отходов или их смесях. Выращивание на среде с пшеничной мукой и мелассой (в пропорции 1 : 1) обеспечивало получение н-бутанола при себестоимости 800–900 руб./т (в ценах 1980-х гг.) при суммарном расходе сырья 6 т на 1 т органических растворителей (см. табл. 3.23) и доле н-бутанола в ацетонбутанольной смеси около 60%.

По сравнению с этанолом н-бутанол как автомобильное топливо имеет более высокое октановое число и энергию сгорания, близкую к таковой для бензина, может добавляться в более высоких концентрациях к бензину при использовании в стандартных автомобильных двигателях, обладает меньшей летучестью, смешивается с бензином и дизельным топливом в любых соотношениях, негигроскопичен, его смеси с бензином в присутствии воды в меньшей степени склонны к расслоению и поэтому для использования бутанол-бензиновых смесей не требуется переоснащения существующей сети хранилищ, установок для смешивания, систем транспортировки и автозаправочных станций. Однако биотехнология получения биобутанола более сложная (требуются строго анаэробные и асептические условия, сложно осуществить более производительный непрерывный процесс культивирования), выход из сырья ниже (15–20%, максимум 25% при потреблении глюкозы), выше затраты на отгонку, поэтому

исебестоимость н-бутанола существенно выше. Образуемый в ходе брожения н-бутанол уже в концентрации 1,5% подавляет жизнедеятельность бактерий и брожение, поэтому в процессе не используются среды с большим количеством сбраживаемых субстратов.

Как и при производстве этанола, особой, весьма серьезной является проблема утилизации барды, остающейся после отгонки н-бутанола.

Снижение себестоимости бутанола возможно путем частичной замены сырья на растительные гидролизаты, увеличения содержания н-бутанола в ферментационной среде, повышения продуктивности реакторов, реализации попутно получаемых продуктов: ацетона, кормовых дрожжей (при утилизации барды), водорода, углекислоты.

Среди других путей совершенствования процесса получения биобутанола

– использование методов ферментации, повышающих степень конверсии субстрата в н-бутанол (за счет снижения доли ацетона и других побочных продуктов); создание штаммов, устойчивых к высоким концентрациям н-бутанола, в том числе штаммов с измененным жирнокислотным составом мембран; использование ферментативных процессов с одновременным извлечением н-бутанола из среды (первапорацией через селективную мембрану, экстракцией несмешивающимися растворителями и другими способами); применение высокотемпературных анаэробных процессов при участии бактерий Clostridium thermocellum, когда одновременно осуществляются и гидролиз субстрата, и ферментация; целенаправленное конструирование методами метаболической инженерии штаммов, образующих в качестве основного продукта только н-бутанол.