Ильина Г.В., Ильин Д.Ю. Ксилотрофные базидиомицеты в чистой культуре

ил)этил]-1-нафтил-2-метилбутират и относится к группе лактонов гексагидронафталина (рис. 6).

Рисунок 6 – Химическая структура монаколина К (ловастатина) и некоторых аналогов

Позже подобные соединения были обнаружены в мицелии и плодовых телах нескольких видов грибов рода Pleurotus (GundeCimerman et al., 1993; Gunde-Cimerman, Cimerman, 1995). Для

P. ostreatus установлено содержание ловастатина в плодовых телах, особенно в гимениальном слое; для P. saca, P. sapidus показано содержание названного вещества в культуральной жидкости

(Gunde-Cimerman, Cimerman, 1995). Есть сведения о преимуще-

ственном синтезе в организме животных и человека под воздействием стероидов грибного происхождения высокоплотного типа холестерина, не способного к формированию «бляшек» на стенках сосудов, на фоне угнетения синтеза холестерина низкой плотности, ответственного за закупорку сосудов и патологические последствия этого явления (Bobek et al., 1991). Дополнение 4% сухого порошка грибов рода Pleurotus к пище эффективно снизило накопление холестерина в сыворотке и печени экспериментальных крыс, а также обеспечило перераспределение холестерина в пользу высокоплотного, при угнетении синтеза холестерина низкой и очень низкой плотности. Довольно давно установлено, что соединение эритаденин, извлеченное из Lentinus edodes в состоянии понизить уровень общего холестерина сыво-

60

ротки крови. В опытах in vivo на мышах показано, что эффект эритаденина связан не с угнетением биосинтеза холестерина, а с ускорением его метаболического разложения и выведения (Susuki, Oshima, 1974). Несколько позже обнаружено, что грибы рода Lentinus при включении их в диету способны понижать кровяное давление и уровень свободного холестерина в плазме, ускорив накопление липидов в печени, удаляя их из обращения (Kabir, Kumura, 1989). Было показано, чтобы высокие дозировки эритаденина могли снизить содержание в плазме холестерина низкой плотности. Подобно диетическому белку сои, эритоденин понижает уровень холестериа, сокращая отношение фосфатидилхолина к фосфатидилэтаноламину в микросомах печени

(Sugiyama, Yamakawa, 1996).

Диетологи уже несколько десятилетий предлагают немедикаментозный способ регулирования уровня холестерина в крови. В частности, позитивный эффект при гиперхолестеринемии показала модификация пищевого режима в пользу грибов. Грибы вообще, а конкретно представители родов Pleurotus, Lentinus и Grifola из-за их высокого содержания волокна, стеринов, белков, микроэлементов и низкой калорийности, почти идеальны для диет, разработанных, чтобы предотвратить сердечно-сосудистые болезни (Breene, 1989; Hobbs, 1995). Другим современным направлением модификации диет при помощи грибов может служить косвенный путь. Использование мицелия Trametes versicolor, Ganoderma lucidum, Schizophillum commune, Pleurotus ostreatus, P. sajor-caji, Lentinus edodes и других видов для корм-

ления домашней птицы способно понизить содержание холестерина в мясе и обеспечивает получение полноценного белкового продукта с диетическими свойствами (Song et al., 2003).

Помимо гиполипидемических начал некоторые из базидиальных макромицетов характеризуются гепатопротекторными эффектами. Спиртовой экстракт мицелия G. lucidum оказывает выраженное гепатозащитное действие, активным началом которого выступают ганодестерон и некоторые типы ганодеровых кислот. При приеме алиментарно сухого порошка G. lucidum достигается положительный эффект и у больных с гематомами печени (Бисько, Митропольская, 2001, Russel, Paterson, 2006). Подобные активные «начала», а также сходные по структуре и свойствам

61

соединения обнаружены и у других видов рода Ganoderma, в частности, G. applanatum (Ковалева, 2009). Экстракцией с помощью раствора хлороформа в метаноле были получены и хроматографически идентифицированы тритерпеноиды, идентичные ганодериковой и ганодерениковой кислотам (Boh et al., 2000).

На Российских и иностранных фармацевтических сайтах приведено множество данных о положительном воздействии БАВов на основе плодовых тел и мицелия G. lucidum на сердечную, мозговую деятельность, обмен веществ, систему иммунитета. Указывается их противовирусная активность, способность подавлять опухолевый рост, снижать уровень холестерина в крови и кровяное давление (http://www.biotika-s.ru/p9.htm). Ряд обзоров,

посвященных вопросам разработки и практического применения БАВов на основе G. lucidum содержат подробную информацию об их положительных эффектах при лечении гепатита В, диабета, гипертензии, миелобластической лейкемии, некоторых форм карциномы, незаживающих ран на фоне диабета (Тeow, 1986, 1997). При этом эти эффекты объясняются активностью не только описанных выше ингредиентов (полисахаридов и тритерпенов), но и присутствием в мицелии и плодовых телах органических соединений германия, аденозина, ценных аминокислот, сапонинов, алкалоидов, водорастворимых белков, кумарина и большого числа микроэлементов: Ag, Ca, Fe, К, Na, Mn, Zn, Ba. Калия почти всегда больше всех остальных элементов, затем следуют P, Ca, Mn, Na. В менее значительном количестве обнаруже-

ны Fe, Mg, Zn, Cu, Mo и B (http://dara-piter.nm.ru).

В последние годы многие лечебные эффекты G. lucidum связывают и с высоким содержанием органического германия – элемента, обеспечивающего наиболее эффективное усвоение кислорода в клетках организма и оказывающего антиоксидантное и антистрессовое действие (Shiao, 1994). Органический германий, по данным исследователей, нормализует проведение нервных импульсов, устраняя или сокращая эффекты нарушенной проводимости клеток в пределах очага воспаления (Lim, 1998). Факт повышенного, по сравнению с растительными и животными организмами (в среднем, в 50-100 раз) накопления германия грибами, а именно ксилотрофными базидиомицетами, описан в работах отечественных ученых (Воронков, Мирсков, 1982).

62

Фермент супероксидисмутаза, обнаруженный в культуральной жидкости G. lucidum, за счет способности связывать свободные радикалы в клеточной протоплазме (антиоксидантная активность), способен защитить ДНК клетки от окислительного стресса (Бадалян, и др., 2003). Тот факт, что многие ксилотрофные базидиомицеты являются потенциальными источниками биоантиоксидантов, широко часто упоминается в литературе.

Липиды G. lucidum содержат в основном ненасыщенные жирные кислоты (витамин F), к которым относятся линолевая и линоленовая кислоты. Линолевая кислота является предшественником эйкозапентаеновой кислоты, из которой синтезируются простагландины и тромбоксаны, которые стимулируют иммунозащитные реакции и противоопухолевый иммунитет. Так как простагландины являются тканевыми гормонами, очевидно, что витамин F играет регуляторную роль в жизнедеятельности клеток (Морозкина, Мойсеенок, 2002). Плодовые тела G. lucidum богаты витаминами, главным образом ВЗ, В5, С и D (Wachtel-Galor, Tomlinson, Benzie, 2004).

Отдельным направлением современных исследований является изучение антимикробной и противовирусной активности базидиальных макромицетов, в том числе ксилотрофов. Из макромицетов выделено около 60 веществ с антибиотическими свойствами, активных в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, патогенных грибов, включая дрожжевые. Действующие вещества принадлежат к различным классам химических соединений – терпеноидам, хинонам, пуринам, пиримидинам, производным фенолов. Антибиотические вещества, продуцируемые макромицетами, по эффективности несколько уступают микробным антибиотикам, однако характеризуются более низким уровнем токсичности (Белова, Ефремова, 1999). Среди важных достижений в этом направлении можно отметить обнаружение в культуральной жидкости Phanerochaete velutina метаболитов, обладающих избирательной активностью в отношении Helicobacter pilori (Краснопольская, Белицкий, 2001). Выявлено, что экстракты из грибов рода Lentinus могут ингибировать развитие вирусов гриппа in vivo и in vitro. Активность против вируса иммунодефицита человека в системе ткани показали экстракты из Grifola frondosa, Lentinus edodes. Описан противовирусный

63

эффект экстрактов из плодового тела Trametes versicolor r вирусу

HIV RT иммунодефицита человека (Jianbin et al., 2007).

В настоящее время значительное внимание исследователей уделяется клеточной стенке грибов (Феофилова и др., 2000). В совместной работе авторы указывают, что составляющие клеточной стенки высших грибов могут быть использованы как сорбенты канцерогенных веществ и ионов тяжелых металлов в же- лудочно-кишечном тракте. В разных областях хозяйственной деятельности человека, а в настоящее время наиболее интенсивно в технологии готовых лекарственных средств, в качестве биологически активного вещества и вспомогательного материала, используется хитин грибов. Хитин (поли–N–ацетил–D– глюкозамин) – основной полисахарид клеточной стенки. Это широко распространенный в природе полимер, по ряду своих физи- ко-химических свойств напоминающий целлюлозу. В природе хитин не присутствует в чистом виде, а связан ионными или ковалентными связями с другими соединениями. У грибов хитин связан с глюканами (Феофилова, 2004). В целом, такая структура носит название хитиново-глюкановый комплекс (см. далее по тексту ХГК). ХГК высших грибов предложено использовать для лечения ряда заболеваний, вызываемых бактериями и вирусами (Нудьга и др., 2001). Особый интерес ХГК вызывает как аналог пищевых волокон. Эти волокна сорбируют в желудочнокишечном тракте канцерогенные вещества, ионы тяжелых металлов и радионуклиды, активируют деятельность желудка. В последние годы пищевым волокнам придается особое значение в профилактической медицине, в связи с их возможными антиканцерогенным и антимутагенным эффектами. Лекарственные препараты из структурных полисахаридов клеточной стенки – хитина и глюканов используются в офтальмологии, комбустиологии и т.д.

Среди физиологически активных соединений, присутствующих в мицелии базидиальных грибов, особое место занимают каротиноидные пигменты, которые участвуют в окислительном обмене и депонировании кислорода в клетках при старении организма. Каротиноиды представляют собой полиеновые соединения изопреноидной природы и обладают гиполипидемическими, антисклеротическими, антимутагенными и антиканцерогенными

64

свойствами. Одним из представителей базидиальных грибов, пригодных в пищу и способных к синтезу каротиноидных пигментов, является Laetiporus sulphureus (Гвоздкова и др., 2003, 2008). Основой разработанной биологически активной добавки (БАД) «Летипорин» является субстанция, представляющая собой сухой порошкообразный мицелий красно-оранжевого цвета, полученный на основе базидиального гриба Laetiporus sulphureus (Гвоздкова и др., 2006). Носителем биологической активности мицелия гриба, по данным авторов разработки, является именно липокаротиноидный комплекс. L. sulphureus, кроме того, характеризуется наличием в глубинном мицелии целого ряда комплекса биологически активных липоидных соединений: полиеновых жирных кислот, стероидных соединений, фосфолипидов (Капитанов, Пименов, 1996; Дзыгун, Дудка, 2008). Действительно, в липидной части мицелия, составляющей 20–25% в расчете на сухое вещество (СВ), наиболее важными и физиологически активными компонентами являются полиеновые пигменты каротиноидной природы (0,8–1,0%), фосфолипиды (4–7%), стероидные соединения, в том числе, провитамин Д (более 1,0%) от воздуш- но-сухого мицелия и тритерпеновые кислоты. В составе липидов мицелия гриба L. sulphureus содержатся насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты с четным числом атомов углерода (от 12 до 18). Из насыщенных жирных кислот преобладает пальмитиновая кислота (13–16% от общей суммы кислот). Более 65–70% приходится на долю линолевой кислоты. Липокаротиноидный комплекс мицелия гриба L. sulphureus характеризуется высокой антиокислительной активностью (70–90% от АОА ионола), которая обусловлена не только природой входящих в него компонентов, но и их синергическим взаимодействием (Гроздкова и др., 2006). В экспериментах in vivo установлен высокий потенциал антиоксидантного действия БАД «Летипорин», ее радио- и гепатопротекторные свойства. Способность к активному синтезу каротиноидов является индивидуальной особенностью данного вида, поскольку не известна у других видов базидиомицетов. Указаны антимикробные свойства мицелия и вытяжек из плодовых тел L. sulphureus (Тихонова и др., 2010). В базидиомах этого вида обнаружен холин, который входит в состав лецитинов и является метилирующим агентом в биологических процессах. При отсут-

65

ствии или недостатке холина в организме человека возрастает риск заболеваний печени. Кроме того, отмечено наличие в плодовых телах бетаина, гистидина, герцинина, производных имидазола, обладающих физиологической активностью (Шиврина, 1965). По данным А.Н. Шивриной и О.П. Низковской (1969), L. sulphureus активно синтезирует эргостерол, из которого в настоящее время биотехнологически осуществляется синтез кортизана – препарата гормона коры надпочечников, применяемого в медицине как противовоспалительное и противоревматическое средство (Озерова, 2006).

В последние годы резко возрос интерес исследователей и крупных фармацевтических компаний к высокомолекулярным пигментам фенольной природы – меланинам. Природные меланины характеризуются широким спектром фармакологического действия: антиоксидантным, гено- и радиопротекторным, иммуномодулирующим, гепатопротекторным. Эти пигменты используются как составляющая косметологических средств, обладающих фотопротекторной активностью, а также сорбентов радионуклидов и ионов тяжелых металлов. Возможности промышленного получения различных меланинов из природных источников весьма ограничены. Решением вопроса поиска альтернативных путей его получения может быть биотехнологический процесс направленного синтеза меланина с помощью грибовпродуцентов. В лаборатории экспериментальной микологии Института микробиологии НАН Белоруси проводятся исследования по выявлению активных продуцентов меланинов среди микро- и макромицетов. По представленным данным, среди макромицетов перспективны ксилотрофные базидиомицеты Inonotus obliquus и Phellinus robustus (Бабицкая и др., 2007). В исследова-

ниях авторы установили различия электронных спектров меланиновых комплексов, полученных из грибов различных таксономицеских групп. Показано, что экзо- и эндомеланины, продуцируемые макромицетами, являются меланопротеидами и незначительно отличаются между собой по физико-химическим свойствам. Их относят к пирокатехиновому типу. Авторами в серии экспериментов установлены антиоксидантные и генопротекторные свойства грибных меланинов, что свидетельствует о пер-

66

спективе их использования при создании антиканцерогенных препаратов.

По существующим оценкам в настоящее время около 3% населения планеты инфицировано вирусом гепатита С, при котором хронический гепатит формируется у 70–80% больных. Наиболее перспективным в лечении этой патологии отношении является Микотон – препарат из высших базидиальных грибов, обладающий всем спектром биологических активностей. Он представляет собой меланин-глюкан-хитиновый комплекс с сохраненной архитектоникой клеточной стенки грибов (Вовк и др.,

2006).

В Украине, на основе комплекса трутовых грибов, получен новый меланин-гликановый комплекс с высокой биологической активностью, который показал мощные генопротекторные свойства, позволяющие снизить повреждающие ДНК эффекты проникающей радиации, химических мутагенов (Сенюк и др., 2008). В экспериментах in vitro и в опытах с использованием лабораторных животных было показано, что данный препарат способен практически нивелировать эффекты хронического облучения в малых дозах и существенно облегчить последствия острого радиационного облучения на однонитевые разрывы ДНК.

Таким образом, приведенные данные свидетельствуют о широких перспективах использования ксилотрофных базидиомицетов в качестве источников лекарственных и профилактических соединений, биологически активных добавок к пище. В связи с этим, продолжает оставаться актуальным как поиск новых продуцентов, скрининг перспективных штаммов, идентификация действующих начал, так и исследование возможностей регуляции и интенсификации процессов синтеза.

1.4 Возможности регуляции развития культуры продуцента и ее биосинтетической активности

Последние несколько десятилетий активно ведутся глубокие исследования физиологии высших грибов и возможностей регуляции их развития. Требуют подробного изучения сложные физиологические и биохимические процессы, происходящие при росте и развитии грибного организма. Их интенсивность опреде-

67

ляется наследственными качествами самого организма и факторами внешней среды (Сидоренко, Ефремова, 2008). При этом кроме факторов, определяемых самим организмом, т.е. вид

иштамм гриба, возраст культуры, способность к вегетативному размножению и образованию биологически активных веществ, интенсивность дыхания и другие, необходимо учитывать и регулировать факторы внешней среды, влияющие на физиологические и биохимические процессы, как важнейшие факторы, определяющие активность гетеротрофных организмов (Дворнина, 1990; Цивилева, 2008; Яценко, Бойко, 2010). Не менее важная задача – добиться управляемого биосинтеза как первичных, так

ивторичных продуктов метаболизма за счет использования лимитирующих факторов питания, существенно влияющих на синтез целевого продукта.

Практика производства метаболитов мицелиальных грибов имеет множество примеров использования таких возможностей. Поскольку базидиальные грибы в качестве продуцентов ценных метаболитов и активных начал имеют не столь значительную историю, вопросы регулируемого синтеза, а также управления развитием в их отношении находятся в активной разработке (Фомина и др., 1999; Цивилева и др., 2005). Для этой группы организмов в литературе указывается, что синтез вторичных метаболитов (ферментов, антибиотиков, каротиноидных и меланиновых пигментов) детерминирован не только генетически, но и в определенной мере зависит от внешних факторов, таких как источники углерода, азота и их соотношения, минеральных компонентов питательной среды, а также температуры, рН среды и интенсивности аэрации (Николайчук и др., 2005). В исследованиях, посвященных изучению факторов регуляции синтеза меланиновых пигментов штамма Inonotus obliquus проведен анализ действия ряда регулирующих рост и процессы метаболизма факторов (Щерба и др., 2007; Черноок и др, 2008). В качестве источников углерода для I. obliquus служили арабиноза, ксилоза, галактоза, глюкоза, фруктоза, сахароза, мальтоза, лактоза, целлобиоза, манит, сорбит, крахмал, ржаная мука, Na-янтарнокислый, щавелевокислый, малоновокислый. Максимальный выход меланина

(0,87г/л) наблюдался на среде, содержащей целлобиозу. I. obliquus также активно использовал глюкозу, арабинозу, ксило-

68

зу, маннит и сорбит, где выход меланина составил 0,60 – 0,65 г/л. То, что на среде с целлобиозой гриб синтезировал наибольшее количество пигмента, авторы объясняют аналогией с его питанием в природных условиях, где целлюлоза под действием гидролитических ферментов расщепляется до целлобиозы и используется как источник углерода. Исследование источников азотного питания показало, что минеральный азот не оказывал существенного влияния на синтез меланина I. obliquus, а среди органического азота лучшим оказался пептон. Из литературы известно, что внесение в среду культивирования ионов меди в определенной концентрации стимулирует рост грибов и синтез вторичных метаболитов. Проведенные исследования показали, что оптимальное содержание ионов меди для синтеза меланина составило 0,008%. Исследование влияния на меланиногенез ароматических соединений показало, что моноциклические добавки пирокатехин, тирозин, бензойная и пара-оксибензойная кислоты стимулируют синтез меланина, тогда как фенол и бициклическая добавка 2- нафтол, напротив, ингибируют его (Щерба и др., 2007).

На наш взгляд, огромное значение имеют и сами метаболиты, образуемые в процессе жизнедеятельности культуры. С этих позиций, для выбора оптимальной технологии культивирования с учетом использования регуляторных приемов, нужно, прежде всего, учитывать особенности различных этапов развития культуры. Известно, что рост микроорганизмов можно охарактеризовать как S - образную кривую. За фазой адаптации (лаг-фазой) следует первая стадия - стадия быстрого роста, или логарифмическая, для которой характерен синтез первичных метаболитов. Далее наступает фаза медленного (стационарного) роста, когда увеличение биомассы клеток резко замедляется. Микроорганизмы, производящие вторичные метаболиты, вначале проходят стадию быстрого роста, трофофазу, во время которой синтез вторичных веществ незначителен. По мере замедления роста из-за истощения одного или нескольких необходимых питательных веществ в культуральной среде микроорганизм переходит в идиофазу; именно в этот период синтезируются идиолиты. Считается, что они вырабатываются клетками для адаптации к условиям окружающей среды, например, для защиты. Идиолиты, или вторичные метаболиты, не играют явной роли, однако могут играть кос-

69