Ильина Г.В., Ильин Д.Ю. Ксилотрофные базидиомицеты в чистой культуре

и медленнорастущих культур базидиомицетов (Денисова (Ильина), 1999; Блинохватов и др., 2000; Иванов и др., 2000; Ильина, Сашенкова, 2002).

Повышенное содержание германия и активное накопление названного элемента базидиомами и мицелием грибов рода Ganoderma активно обсуждается в последние годы (Song et al., 2003). Факт повышенного, по сравнению с растительными и животными организмами (в среднем, в 50-100 раз) накопления германия грибами, а именно ксилотрофными базидиомицетами, описан в работах отечественных ученых (Воронков, Мирсков,

1982).

Микроорганизмы, как и прочие организмы, нуждаются в оптимизирующих развитие факторах, они позитивно реагируют на присутствие в питательной среде витаминов, аминокислот, цитокининов и других биологически активных веществ. Для многих базидиальных макромицетов в культуре рекомендуется внесение комплекса аминокислот и тиамина хлорида, предложена среда для базидиомицетов следующего состава (г/л): D-Glc - 10; L-Asn - 1; KH2PO4 - 5; MgSO4.7H2O - 2.5; FeSO4.7H2O - 0.03; тиамин - 5.10-4; H2O до общего объема 1 л (Song et al., 1987, цит. по Цивилева, 2008). Именно высшие базидиомицеты характеризуются выраженной гетеротрофностью в отношении тиамина, что выделяет их среди грибов других систематических групп. Потребность в этом витамине была установлена у многих видов съедобных грибов, относящихся к родам Boletus, Suillus, Paxillus, Pleurotus, Panus, Lentinus, Tricholoma, Flammulina, Collybia, Agaricus, Russula, Lepiota, Coprinus, Clitocybe, Mycena, Pholiota, Lactarius, Stropharia и др. В то же время потребность в тиамине у высших баэидиомицетов не является абсолютной. Например,

выявлены штаммы видов Agaricus bisporus, Pleurotus ostreatus,

некоторых видов рода Marasmius, автотрофные в отношении тиамина (Биосинтетическая деятельность..., 1969).

А.С. Бухало с сотрудниками исследовано влияние на рост высших базидиомицетов тиамина, отваров растений, дрожжевого автолизата, других субстратов, содержащих витамины (Бухало, 1988). При этом было установлено, что на синтетической среде с тиамином больше биомассы, чем в контроле, образуют Panus conchatus, Armillariella mellea, Coprinus comatus и Macrolepiota

40

procera, отдельные штаммы Pleurotus ostreatus и Flammulina velutipes. Стимулирующее действие на рост Fistulina hepatica, Pleurotus ostreatus, Armillariella mellea, Kuehneromyces mutabilis, Macrolepiota procera, Panus tigrinus, Flammulina velutipes и другие виды оказывают отвары крапивы и дубовой коры, дрожжевой автолизат. В качестве стимуляторов на синтетической среде с сахарозой испытаны отвары зеленой массы различных сельскохозяйственных культур. На всех средах с растительными стимуляторами, по сравнению с контролем, Fistulina hepatica, Panus conchatus, Armillariella mellea, Kuehneromyces mutabilis отдельные штаммы Pleurotus ostreatus, Flammulina velutipes и другие виды увеличива-

ют продукцию биомассы. Эти культуры слабо растут на контрольной синтетической среде. Показана целесообразность использования естественных органических субстратов, содержащих витамины и другие стимуляторы, в качестве компонентов питательных сред для улучшения роста и увеличения продукции биомассы мицелия при культивировании высших съедобных базидиомицетов.

С наступлением эры антибиотиков, а позже – биологически активных добавок и в связи с широким применением микроорганизмов в разных отраслях промышленности остро встал вопрос об экономически оправданных, сбалансированных по составу питательных средах. Эффективной добавкой оказался, благодаря наличию в нем витаминов, аминокислот и минеральных элементов в легко ассимилируемых формах, кукурузный экстракт (Мосин, 2002). Кроме кукурузного экстракта в рецептуры сред включают дрожжевой автолизат, дрожжевой экстракт, гидролизат дрожжей, клеточный сок картофельных клубней, молочную сыворотку, экстракт пшеничных отрубей, экстракт солодовых ростков и другие продукты. В целях снижения затрат на ингредиенты для питательных сред в настоящее время широко используются отходы сельского хозяйства и перерабатывающей промышленности (Обрезкова и др, 2010). Например, предложено в качестве источника углерода, азота, фосфора, микроэлементов, а также индуктора ферментов использовать прогидролизованный ячменный солод; в качестве стимуляторов роста и биосинтеза ферментов - прогидролизованные солодовые ростки; в качестве индуктора пектолитических ферментов - прогидролизованный свекловичный жом (Салманова, Соболевская, 1994).

41

В последние десятилетия как быстрый и эффективный метод производства посевного материала для грибоводства предлагается также глубинное культивирование (Yang, Jong, 1989). Очень небольшое число работ посвящено биохимии глубинного культивирования, ее связи с физиологией роста и развития грибного организма в глубинной культуре. Необходимым условием роста и развития мицелия базидиальнх макромицетов в глубинных условиях является достаточное количество кислорода. Потребность аэробных микроорганизмов в молекулярном кислороде зависит от источника окисляемого источника углерода и от физиологических свойств и активности роста микроорганизмов. Растворимость кислорода в среде сравнительно низка и зависит от температуры, давления и от концентрации растворенных, эмульгированных и диспергированных компонентов. При давлении 0,1 МПа (1 кгс/см2) и температуре 30°С в 1 л дистиллированной воды максимальное количество растворенного кислорода составляет 7,5 мг. В реальной питательной среде максимальная растворимость кислорода 2 – 5 мг/л. Запасы кислорода в среде обеспечивают жизнедеятельность аэробного продуцента в течение 0,5 – 2 мин (Мосин, 2002). При глубинном культивировании запасы кислорода в питательной среде возобновляются при подаче аэрирующего воздуха. Скорость адсорбции кислорода увеличивается с ростом интенсивности перемешивания среды. Установлено, что во время роста биомассы микроорганизмы обычно потребляют больше кислорода, чем во время сверхсинтеза целевого метаболита.

Реакция погруженных культур ряда видов ксилотрофных базидиомицетов на изменение содержания кислорода в среде описана нами (Ильина, 2008).

Значительная часть сред, рекомендованных для выделения культур грибов, содержит селективные компоненты. Для подавления роста бактерий нередко добавляют противобактериальные антибиотики или снижают рН среды. С целью подавления роста грибов, сопутствующих выделяемому виду, кроме противогрибных антибиотиков используют и другие фунгицидные препараты

– бычью желчь, кристалл-виолет, пропионат кальция и др. Широко используемой средой для выделения и культивирования как сапрофитных, так и прочих грибов, является декстрозный агар

42

Сабуро, содержащий (г/л): глюкозу 40,0 г; пептон 10,0 г; агарагар 20,0 г при рН 5,6±0,2. Благодаря низкому значению рН, рост бактерий на этой среде подавляется. Однако наибольшее распространение нашли среды, представляющие собой модификации оригинальной среды Сабуро, придающие ей дифференциальнодиагностические свойства. Известной модификацией, используемой в свою очередь в составе других сред, является модификация Эммонса, отличающаяся от оригинальной среды тем, что содержит только 2% глюкозы, вместо 4%, и рН на уровне нейтрального

– 6,9–7,0. Добавлением к среде такого состава антимикробных препаратов в различных комбинациях, включающих циклогексимид, хлорамфеникол, гентамицин, ципрофлоксацин, пенициллин или стрептомицин для ингибирования роста некоторых грибов и бактерий, достигается ее селективность. Aгар Сабуро в модификации Эммонса с добавлением хлорамфеникола (50 мг/л) и циклогексимида (500 мг/л) является селективным и используется для выделения патогенных грибов из биообразцов, высококонтаминированных сапрофитными грибами и бактериями. Эта среда встречается под коммерческими названиями Mycobiotic agar

(Difco), Mycosel agar (BBL).

Признанной микологами – практиками особенностью большинства видов ксилотрофных базидиомицетов является такая их характеристика, как хороший рост в культуре. По сравнению со многими другими представителями грибов, эта группа представлена, в большинстве своем, факультативно-сапротрофными видами, чьи трофические потребности относительно легко удовлетворяются в условиях лабораторного культивирования. Однако, проблемы оптимизации выделения, хранения, поддержания стабильности штаммов остаются весьма актуальными. Разработка новых, адаптированных с учетом узкой трофической специализации, происхождения, возраста сохраняемой культуры, приемов представляется перспективным направлением исследований.

1.3 Ксилотрофные базидиомицеты как перспективный объект биотехнологии

Искусственное выращивание грибов способно внести существенный вклад в дело обеспечения продовольствием возрас-

43

тающего населения земного шара. Грибы употребляют в пищу с глубокой древности, поэтому сделать грибы такой же управляемой сельскохозяйственной культурой, как зерновые злаки, овощи, фрукты, давно уже стало актуальной задачей. Наиболее легко поддаются искусственному выращиванию дереворазрушающие грибы. Это связано с особенностями их биологии, их способность легко расти и плодоносить использовали с древнейших времен.

Искусственное разведение дереворазрушающих грибов получило довольно широкое распространение. Мицелий съедобных грибов, как и мицелий продуцентов антибиотиков можно выращивать на жидких средах, в глубинной культуре. Зачастую это полностью механизированный и автоматизированный процесс. Так, в Институте микробиологии Академии наук Белоруси (1990) разработаны и апробированы в опытном производстве способы получения белковых грибных препаратов даедалина и пантегрина из мицелия дереворазрушающих грибов дедалеопсиса бугристого

(Daedaleopsis сonfragosa) и пилолистника тигрового (Panus tigrinus), с высоким содержанием белка и биологически активных веществ. По содержанию белка 1 кг этих препаратов эквивалентен 2 кг мяса. По биологической ценности белок этих препаратов не уступает растительным и приближается к животным белкам. Перевариваемость белков данных препаратов составляет свыше 80 %. В основе этого способа получения пищевого белка лежат полученные микологами данные о том, что плодовые тела грибов

иих мицелиальная масса близки по своему химическому составу

ипищевой ценности. Исследования в этом направлении продолжаются (Бабицкая и др., 2006).

Ксилотрофные базидиомицеты обладают богатыми комплексами целлюлозо- и лигнолитических ферментов. Целлюлозолитические ферменты очень специфичны, их действие проявляется в деполимеризации молекул целлюлозы. Обычно используются в виде комплекса, доводящего гидролиз целлюлозы до глюкозы (в гидролизной промышленности). В медицинской промышленности их используют для выделения стероидов из растений, в пищевой – для улучшения качества растительных масел, в сельском хозяйстве - как добавки в комбикорма для жвачных животных.

44

Базидиальные грибы, возбудители белой гнили, синтезируют мультиферментный комплекс лигнолитического действия, принимающий участие в процессе деградации лигнина (Клесов, 1985; Рабинович, 2000; Клечак и др., 1999, 2010; Титова и др., 2002; Русинова, 2009; Рагимова, 2010). Неспецифичность ферментов лигнолитического действия и их высокая окислительная способность открывают широкие возможности для использования как самих грибов лигнинолитиков, так и их лигнинолитических ферментов в системах детоксификации и деградации ксенобиотиков, биоремедиации почв и вод (Королева, 2006). Разработка экологически чистых биотехнологий как для обработки и модификации лигнинсодержащих материалов, так и для утилизации лигнинсодержащих отходов (в особенности для целлюлознобумажной и текстильной промышленности), интенсифицировала изучение механизма деградации лигнина базидиальными грибами и роли их лигнинолитических ферментов в этом процессе (Такташев, 2002; Бойко и др., 2008; Древаль, Бойко, 2009).

Вработе Г.П. Александровой и С.А. Медведевой изучена лигниндеструктирующая способность базидиального гриба Daedaleopsis сonfragosa (1999). Показана перспективная возможность использования комплекса оксидазных и ксиланазных ферментов, продуцируемых грибом, для деструкции и снижения содержания остаточного лигнина сульфатных целлюлоз.

Внастоящее время активизировались исследования ферментативной активности отдельных видов ксилотрофных базидиомицетов, результаты которых находят широкое практическое применение. В работе О.Н.Горбатовой и др. (2006), в результате целенаправленного скрининга по лигниндеструктирующей способности (индексу ксилолиза), в качестве объекта исследований был выбран гриб Daedaleopsis сonfragosa. За относительно короткий срок инкубирования (14 сут) при небольшой потере массы древесины (ПМД) (5%) и целлюлозы (всего 0.9%), потери лигнина, вызванные действием Daedaleopsis сonfragosa, составляли 23%. Эти показатели деятельности гриба, с точки зрения эффективности и избирательности делигнификации, несколько лучше, чем для Phanerochaete sanguinea, одного из наиболее известных (Lakshminarayana et al., 1992) лигнинолитических грибов. Биоотбелка сульфатных целлюлоз может осуществляться ферментами,

45

прежде всего, оксидазного типа за счет окислительной деструкции лигнина, что приводит к его функционализации и способствует увеличению растворимости. Среди лигнинразрушающих ферментов известны лигнинпероксидаза и лакказа, которые осуществляют одноэлектронный перенос с молекулы субстрата лигнина – и тем самым катализируют широкую серию далее протекающих с ним реакций. Кроме того, гемицеллюлазные ферменты способны гидролизовать гемицеллюлозы, переосажденные на поверхности целлюлозного волокна, облегчая последующую экстракцию лигнина (Ахмедова, 1992; Дудкин и др., 1991; Ежов и др., 1993). Среди внеклеточных ферментов, продуцируемых Daedaleopsis сonfragosa, выявили наличие лигнинпероксидазной, лакказной, ксиланазной и целлюлазной активностей (Горбатова и др., 2005). Максимальная активность перечисленных ферментов отмечена у гриба на 7 сутки культивирования. Активность лигнинпероксидазы оказалась доминирующей, а целлюлазы – минимальной. Такое сочетание ферментативной активности позволяет считать Daedaleopsis сonfragosa перспективной культурой для использования в процессах отбелки. Обработку небеленой сульфатной хвойной целлюлозы в указанной работе осуществляли семидневной культурой Daedaleopsis сonfragosa и проследили влияние продолжительности обработки на состав сульфатцеллюлозной массы в сравнении с Phanerochae tesanguinea.

Известно, что грибы белой гнили могут разрушать пестициды, полициклические ароматические углеводороды, полихлорированные ароматические соединения, красители и т.д. (Mori, Kondo, 2002). Наибольший интерес в качестве биодеструктора пестицидов вновь вызывает Phanerochaete chrysosporium, способный минерализовать хлор- и фосфорсодержащие органические пестициды (Pointing, 2001). В этих превращениях главную роль играют основные окислительные ферменты грибов. У базидиомицетов к ним относятся лигнинпероксидазы (ЛиП, E.C. 1.11.1.14), марганецпероксидазы (MnП, E.C. 1.11.1.13) и голубые лакказы (E.C. 1.10.3.2). Все они обладают широким спектром действия (Диксон, Уэбб, 1982). Лакказы – самые распространенные представители ферментов, способные преобразовывать ароматические соединения. Большинство лакказ окисляет ароматические соединения со свободным фенольным гидроксилом, ами-

46

нофенолы, ароматические диамины (Болобова, 2002). Лакказы успешно используются при деградации трихлорфенолов, алкенов, красителей, пестицидов и др. Часть лакказ стимулируется индукторами – гваяколом, таннином, феруловой и синаповой кислотами, сирингалдазином, 2,5-ксилидином, вератровым спиртом, гуминовыми кислотами и др. (Беккер, 1993). С другой стороны,

лакказы Lentinus edodes, Agaricus bisporus, Schizophyllum commune – типично конститутивные ферменты, биосинтез которых определяется собственным метаболизмом гриба (Горбатова и др., 2000; Болобова и др., 2002; Mougin et al., 2002). При разра-

ботке систем биодеградации значительное внимание уделяется более стабильным препаратам иммобилизованных ферментов. Для лакказ также показано более длительное сохранение активности после иммобилизации. Иммобилизованную лакказу совместно с медиатором используют для окисления токсикантов, в частности – промышленных красителей. Методом иммуноферментного анализа было проведено сравнение эффективности деградации атразина тремя базидиальными культурами: Coriolus hirsutus, Coriolopsis fulvocinerea (лакказная активность преобладает над MnП) и Cerrena maxima (MnП активность выше лакказной) (Горбатова и др., 2006; Королева, 2006). В качестве индукторов использовались гваякол и сирингалдазин. Обнаружена взаимосвязь между деградацией гербицида и лакказной активностью штаммов. Наиболее эффективной оказалась деструкция культурой C. fulvocinerea, индуцируемой гваяколом: утилизировалось до 98% атразина. В остальных вариантах опытов деградация также была высокой и достигала 68–94%. Таким образом, возбудители белой гнили C. maxima, C. fulvocinerea, C. hirsutus, активные продуцен-

ты лакказы, разлагали до 80–92% атразина в течение 40 суток. Исследован процесс биодеградации нефтяных углеводоро-

дов при участии ксилотрофного базидиомицета Lentinus tigrinus (Костина, 2009). Показано, что при культивировании гриба на среде, содержащей 1% дизельного топлива, убыль данного гидрофобного соединения составляет к 10 суткам роста 39,7%. При этом совместное культивирование L. tigrinus с культурой признанного активного нефтедеструктора – бактерии Rhodococcus erythropolis, привело к увеличению убыли поллютанта, по сравнению с эффектами монокультивирования бактерии.

47

В эксперименте с добавлением к питательной среде для культивирования L. tigrinus фенола в концентрации 1% и 5% обнаружено, что степень деструкции вещества зависит от его концентрации, времени внесения, динамики ферментативной активности, и составляет в среднем 70% от исходного содержания (Паршин и др., 2008). При этом обнаружена стимуляция ферментативной активности внесением фенолов: наибольшее стимулирующее действие на биосинтез Mn-пероксидазы оказывало добавление фенолов в концентрации 1%, а лакказы – в концентрации 5% в период трофофазы, а максимальная активность пероксидазы наблюдалась при добавлении 5% фенола в идиофазу.

Биоремедиация объектов окружающей среды может осуществляться и на основе таких свойств грибов, как абсорбционные способности, также перспективным сорбентом поллютантов является хитин клеточной стенки. Было обнаружено большое количество хитина в составе ХГК G. applanatum, а также присутствие в составе плодовых тел протеинов, что обуславливает хорошую сорбционную способность данного вида по отношению к ионам тяжелых металлов (Феофилова, 2002). Кроме того, установлено, что хитино-глюкановый комплекс G. applanatum составляет 1220% общей массы культивируемого мицелия, благодаря чему, данный вид афиллофороидных грибов может быть рекомендован для промышленного получения хитина (Нудьга и др., 2002). Проведено изучение сорбционной способности по отношению к ионам стронция дереворазрушающих грибов известных своими ле-

карственными свойствами – Trametes hirsuta, Pleurotus ostreatus, Lentinus edodes, Ganoderma lucidum (Ровбель, 2006). Результаты исследования показали, что среди изученных грибов наиболее высокой способностью связывать ионы стронция обладает мицелий гриба G. lucidum, полученный при выращивании на жидкой питательной среде в условиях аэрации. Глубинный мицелий G. lucidum отличался наличием на поверхности мелкодисперстных гиф плотного слизистого слоя, основным компонентом которого служил гликан. Тот факт, что после очистки хитинглюканового комплекса гриба от других компонентов биомассы сорбционная емкость снизилась в 2 раза, свидетельствует о способности экзогликанов G. lucidum концентрировать стронций. У других изученных грибов наиболее высокой сорбционной актив-

48

ностью по отношению к ионам стронция характеризовался мицелий, выращенный в поверхностной культуре и выделенный из него хитин-глюкановый комплекс. Проведенные исследования, по мнению авторов, свидетельствуют о том, что использование в диетическом питании хитин-глюканового комплекса, являющегося основным структурным компонентом клеточных стенок, которые остаются в качестве отхода после извлечения экстрактов грибов с лекарственными свойствами, способно защитить человека от негативных последствий хронического поступления в организм радиоактивного стронция.

В соответствии с современными подходами к решению проблемы биодеградации ксенобиотиков, рекомендуют использовать ассоциации микроорганизмов, так как они более эффективны, чем отдельно взятые виды. При этом типы связей в подобной ассоциации могут быть различны. Один вид микроорганизмов может непосредственно участвовать в разложении ксенобиотиков, а другой – поставлять недостающие питательные вещества. Это может быть метаболическая «атака» на субстрат, когда синтезируются разные компоненты ферментативного комплекса, или же цепочка ферментативных реакций (многосубстратные конверсии) и т.д.

Еще одним достойным определенного внимания направлением использования ксилотрофных базидиомицетов стали разработки на основе их мицелия витаминных и антиоксидантных премиксов для применения в разных отраслях животноводства (Капич, Шишкина, 1992). Для промышленного птицеводства актульным и практически значимым является поиск источников биоактивных липидных соединений, особенно природного происхождения, разработка способов получения лечебнопрофилактических препаратов с широким спектром биологического действия (Трояновская и др., 2008). В качестве одного из таких источников БАВ используется L. sulphureus, глубинный мицелий которого содержит уникальный комплекс биологически активных веществ липидной природы (каротиноиды, фосфолипиды, полиеновые кислоты, провитамины и др.). Исследование биохимического состава спиртового экстракта его мицелия, как основы лечебно-профилактического препарата иммуностимулирующего и антиоксидантного действия, показало, что основная

49