Ильина Г.В., Ильин Д.Ю. Ксилотрофные базидиомицеты в чистой культуре

конденсированный продукт. Реакции, обратные ферментативной деструкции, обнаружили и при выращивании грибов

Heterobasidion annosum и Coriolus versicolor на лигнине молотой древесины, сульфатном лигнине и лигносульфонатах (Cote, 1968). Модельные эксперименты указывают на образование бифенильных структур в результате ферментативной дегидратации. Эту реакцию, по-видимому, вызывает лакказа, так как добавка ингибиторов лакказы предотвращает конденсацию. Добавление целлюлозы к культуре Pleurotus ostreatus на лигносульфонатах ингибировало реакции образования полимеров (Crawford, 1981). Целлюлоза превращается в целлобиозу – совместный субстрат (косубстрат) для целлобиозохиноноксидоредуктазы. Этот фермент уменьшает число фенольных радикалов и тем самым ингибирует полимеризацию.

Конденсированные лигнины, содержащие дифенильные связи, проявляют высокую устойчивость к действию ферментов грибов (Chen et al., 1981). В лиственном лигнине и искусственном гваяцил-сирингильном лигнине сирингильные элементы подвергаются деструкции быстрее, чем гваяцильные. Это объясняется большим содержанием в гваяцильной части лигнина дифенильных структур, у которых фенольные гидроксильные группы не склонны к образованию феноксильных радикалов (Фенгел, Вегенер, 1988).

Таким образом, существующие обзоры свидетельствуют о существенной дискуссионности проблемы трофического использования грибами такого нестереорегулярного биополимера как лигнин, однако исследования характера динамики метоксильных групп в питательном субстрате, обогащенном лигнином, при лабораторном культивировании грибов белой гнили, на наш взгляд, способно несколько прояснить этот вопрос.

От химической природы и особенностей используемого источника углерода зависит в основном и доступность для мицелиальной культуры того или иного источника азота. Азотистые соединения, которые являются важнейшей составной частью протоплазмы и играют большую роль в обмене веществ у грибов, являются основой белков (Горленко, 1985). Грибы не в состоянии связывать атмосферный азот, а могут принимать его только в форме неорганических солей или органических азотных соеди-

30

нений (Morton, Mc Millan, 1954). Большинство грибов хорошо усваивает аммиачные соли – сульфат аммония, фосфат аммония, а также аммиак из водного раствора. Соли азотной кислоты не всегда хорошо усваиваются (Беккер, 1988). Только некоторые виды дрожжей испытывают потребность в нитратах. Часто источником азота в состав сред включают мочевину. Также как и в случае с источниками углерода, роль источников азота в процессах роста и метаболизма наилучшим образом изучена и описана вотношении продуцентов антибиотиков. На средах с одними источниками азота организмы могут хорошо развиваться, но не осуществляют в данных условиях биосинтеза антибиотика. Это свидетельствует о наличии регуляторной роли доступности азота для его включения в процессы метаболизма (Егоров, 1986). Обычно в средах для культивирования микроорганизмов в качестве источника азота используют соли азотной (HNO3), или реже соли азотистой (HNO2) кислот, аммонийные соли органических или неорганических кислот (-NH4) или аминокислоты (- NH2), белки и продукты их гидролиза (пептоны, гидролизаты). Как видно, в этих источниках азот находится или в виде окисленной формы (-NO3, -NO2), или в восстановленной форме (NH; - NH2). В натуральных средах неопределенного состава, содержащих соевую муку, кукурузный экстракт и другие подобные компоненты, азот содержится главным образом в форме белков, питательная ценность которых зависит от наличия у микроорганизмов соответствующих протеаз, расщепляющих эти белки, и определяется тем, насколько легко в процессе ферментативного гидролиза из белков освобождается азот в виде аминокислот и несложных полипептидов, а в конечном счете в форме - NH2. Аминокислоты играют существенную роль в метаболизме микроорганизмов. Это объясняется, во-первых, тем, что аминокислоты непосредственно участвуют в синтезе белка (структурного и ферментов) и различных полипептидов; во-вторых, они могут принимать участие в образовании антибиотиков, в том числе и небелковой природы. Аминокислоты могут оказывать заметное влияние на активность ферментов (индуцировать их образование или репрессировать, подавлять активность). Присутствие в среде одних аминокислот может приводить к образованию других.

31

Как уже указывалось, доступность того или иного источника азота зависит в основном от химической природы используемого углерода. Использование аммония и некоторых органических источников азота грибами в большой степени зависит от наличия в среде органических кислот. Небольшие количества (0,1 - 0,2%) дикарбоновых кислот с четырьмя углеродными атомами (например, янтарная, фумаровая) способствуют лучшему усвоению азота. Это, по всей вероятности, связано с тем, что

вданном случае легче образуются кетокислоты, которые, как было указано выше, в свою очередь, связывают аммиак. В этом виде значительно упрощается включение аммиака в метаболизм грибов. Определенную роль в развитии организмов и образовании вторичных метаболитов играют также катионы и анионы солей используемых источников азота (Егоров, 1986). Если организм хорошо использует аммонийную форму азота, то для его развития небезразлично, в какой форме этот аммоний вводится

всреду. При использовании, например, сернокислого и молочнокислого аммония можно получить различные результаты, несмотря на то, что азот представлен одной и той же формой. При использовании сернокислого аммония среда будет сильно подкисляться в результате накопления ионов серной кислоты. Если же будет использоваться молочнокислый аммоний, то резкого сдвига в значении рН субстрата может не произойти, так как освобождающаяся молочная кислота легко может быть использована организмом в качестве источника углерода. Таким образом, в данном случае роль аниона при одной и той же форме азота будет также различной. Все эти факторы необходимо учитывать при изучении развития микроорганизмов и возможностей образования ими метаболитов.

Для продуцентов антибиотиков указывается, что в зависимости от источника азота и формы, в которой он присутствует

всреде, микроорганизм будет в состоянии синтезировать антибиотическое вещество или он будет лишен этой способности (Егоров, 1986). Так, продуцент стрептомицина не образует антибиотика при развитии на средах с нитратами или нитритами

втех случаях, когда они являются единственными источниками азота. Образование стрептомицина происходит на средах с аммонийными источниками азота. Биосинтез пенициллина идет

32

более энергично, если в среде наряду с аммонийным источником азота имеется нитратный источник азота.

Роль особенностей и степени доступности различных источников азота активно изучалась и в отношении высших базидиальных грибов, в том числе, древоразрушающих. Выбор источника азота очень важен для получения хорошего роста мицелия в культуре и высокого содержания в нем протеина (Бухало, 1988). Факт того, что потребность грибов в азоте в значительной мере зависит от снабжения их углеродом, а также от других факторов обсуждается и в отношении базидиомицетов (Маслова, 1969; Биосинтетическая деятельность…, 1969; Berry, 1975; Dijkstra, 1976). Высшие базидиомицеты могут использовать как неорганические, так и органические формы азота. Основными источниками неорганического азота являются аммонийные соли и нитраты. По мнению некоторых исследователей (Биосинтетическая деятельность ..., 1969; Маслова, 1969; Treschow, 1944; Вегту, 1975; Dijkstra, 1976), нитраты не усваиваются или плохо усваиваются многими высшими базидиомицетами. Имеются, однако, сведения, что некоторые виды родов Tricholoma, Coprinus, Collybia, Lentinus хорошо используют нитраты

(Маслова, 1969; Бухало и др., 1972; Rawald, 1963). Органический азот обычно обеспечивает лучший рост мице-

лия, чем минеральные соли азота (Биосинтетическая деятельность...,1969; Маслова, 1969; Dijkstra, 1976). Из органических источников азота для выращивания мицелия съедобных грибов используются мочевина и аминокислоты. Как один из благоприятных источников азота отмечается аспарагин (Berry, 1975). Хорошими источниками азота для высших базидиомицетов являются белки, пептоны, свободные аминокислоты, гидролизат казеина. При исследовании физиологии грибов рода Coprinus (Fries, 1955) показано, что у них существуют видовые и штаммовые различия усвоения разных форм азота. Одни штаммы Coprinus fimetarius способны усваивать нитраты, другие – нитриты. Азотное питание у многих видов высших съедобных базидиомицетов до настоящего времени не изучалось.

В качестве источника азота на синтетической среде с глюкозой А.С. Бухало с сотрудниками испытаны нитратные и аммонийные соли (NaNO3, NH4C1, NH4NO3), а для некоторых ви-

33

дов – также органические соединения азота: аспарагин, мочевина и пептон (Бухало, 1988). Контролем служил рост мицелия на среде с NaNO3. Не все испытанные виды росли на среде с нитратным азотом. Его не усваивают Agaricus bisporus, Lepista nuda, Flammulina velutipes, слабо утилизируют NaNO3 Pleurotus ostreatus, Рanus tigrinus. В то же время, Agaricus hortensis, Armillariella jnellea, Macrolepiota procera, Marasmius scorodonius, Lycoperdon pyriforme и Coprinus micaceus лучше росли на среде с нитратным азотом, чем с аммонийным. На средах с аммонийными источниками азота лучше, чем на среде

снитратным азотом, развивались Schizophyllum commune, Sparassis rispa, Pleurotus ostreatus, Panus tigrinus, P. conchatus, Oudemansiella radicata, Agaricus arvensis, A. silvaticus, Coprinus comatus, Scleroderma citrinus, Suillus variegatus и др. Наилуч-

ший рост испытанных штаммов, кроме Macrolepiota procera и Pleurotus ostreatus, отмечен на среде с органическим источником азота – аспарагином. На среде с мочевиной в указанных исследованиях прекрасно развивались культуры Pleurotus ostreatus, Kuehneromytes mutabilis и Agaricus arvensis, но слабо росли Macrolepiota procera, Agaricus bisporus, Flammulina

velutipes и др. Установлено, что на среде с NaNO3 и аспарагином большинство испытанных штаммов незначительно изменяют рН среды в кислую сторону. При культивировании на среде

саммонийными соединениями азота, являющимися в данном случае солями сильных кислот, 40-50 % испытанных грибов подкисляют питательную среду до рН 3-4. А.С. Бухало (1988) отмечает, что аммонийные соли являются хорошим источником азота для культивирования высших базидиомицетов. Однако в связи с тем, что на синтетической среде с аммонийными солями происходит закисление питательной среды, культивирование следует проводить, используя аммонийные соли слабых кислот.

Проведенные исследования, безусловно, имеют огромное теоретическое и прикладное значение, однако в анализе полученных данных авторами практически не уделяется внимания взаимосвязи между особенностями ассимиляции азота и трофической принадлежностью вида. Однако, на наш взгляд, это перспективная сфера исследований, которая приобретает особое значение в применении к биотехнологически ценным культурам, посколь-

34

ку от источника азота могут зависеть не только ростовые, но и продуктивные показатели. Более того, заслуживает внимания такое направление, как возможности регуляции темпов развития, стимуляции или пассивации метаболических процессов модификацией видов источников азота, дробности их внесения в субстрат и т.п. При направленном биосинтезе, например, целлюлолитических ферментов грибом Peniophora gigantea наивысшая биохимическая активность клеток наблюдается на средах с органическим азотом (аспарагин, пептон и др.) (Мосин, 2002).

Питательные резервы мицелия имеют большое значение для последующего плодоношения (Robert, 1977, 1979; Morimoto et al., 1981). При использовании традиционных методов культивирования вегетативная и репродуктивная фазы развития грибов проходят на едином субстрате. В методах японских авторов (Oyama et al., 1974) вегетативная и репродуктивная фазы обеспечиваются оптимальными условиями питания на разных средах. Причем после появления зачатков плодовых тел все используемые соединения азота поступают из мицелия. Плодовые тела таких видов, как Flammulina velutipes, Panus tigrius, Pleurotus ostreatus и других, легко плодоносящих в культуре, образуются на том же субстрате, на котором сохраняется в лаборатории культура гриба.

В качестве питательных субстратов для получения плодовых тел в лабораторных исследованиях используют пористые материалы, например, смоченные разбавленным пивным суслом или минеральной средой древесные опилки и древесную муку, мелко нарезанные веточки и хвою, высушенный ржаной хлеб с водой, кашицу из хлебных крошек, размягченную в 40 %-ном растворе лимонной кислоты. Многие исследователи занимались разработкой питательных сред для получения плодоношений отдельных видов высших базидиомицетов: Flammulina velutipes Lentinus edodes, Panus tigrinus, Pleurotus ostreatus

и др. (Plunkett, 1953; Leatham, 1983). Однако трудно судить,

оптимальны ли предложенные среды, так как отсутствуют качественные и количественные данные о продуктивности плодоношения грибов на этих средах.

35

Плодоношение можно получить как на твердых, так и на жидких средах в поверхностной культуре, но на жидкой среде плодовые тела обычно появляются позднее (Бухало, 1988).

Состав питательной среды является одним из определяющих факторов, влияющих на плодоношение высших базидиомицетов в условиях чистой культуры (Бухало, 1988). Изучение влияния компонентов питательной среды на плодоношение, проведенное на синтетических средах рядом исследователей, позволило сделать определенные выводы, суммированные Ф. Орриер (Horriere, 1979). Для получения плодоношения в чистой культуре питательные среды должны соответствовать определенным требованиям. Источник углерода в наиболее часто используемых для плодоношения средах вносится в виде углеводов (глюкозы, мальтозы, сахарозы, спирта). У некоторых видов, особенно древоразрушающих грибов, добавление в питательную среду фильтровальной бумаги или соломы стимулирует плодоношение. Азот в такие среды вносится в органической (в виде аланина, аспарагина, других аминокислот) или минеральной форме. В последнем случае предпочтение отдается аммонийным солям.

Большое значение для развития организмов и образования ими метаболитов имеет количественное соотношение источников углерода и азота, содержащихся в среде. Известно, что для наиболее благоприятного роста мицелия в среде должно существовать определенное соотношение между углеродом и азотом, что составляет примерно 20:1 (С:N = 20) (Беккер, 1988). Однако такое соотношение углерода и азота не всегда благоприятно для образования метаболитов. Например, далеко не во всех случаях биосинтез антибиотика происходит пропорционально накоплению биомассы микроба-продуцента (Мосин, 2002). Зачастую при хорошем росте организма не наблюдается образования антибиотика или он синтезируется в небольшом количестве. Поэтому при культивировании штамма с целью образования им веществметаболитов необходимо в каждом конкретном случае подбирать соответствующие соотношения углерода и азота в среде. В питательной среде, предназначенной для получения стадии телеоморфы у базидиальных грибов также большое значение имеет отношение С:N. При его очень высоких показателях плодоношение обычно отсутствует, а при очень низких - образуется много

36

зачатков, но плодовые тела не развиваются (Plunkett, 1953; Sugimori et al., 1971; Horriere, 1979; Бухало, 1988). Оптимальное значение отношения С:N в этом случае приближается к 30, оно зависит от состава среды (Horriere, 1979), некоторое увеличение в которой азота и уменьшение углерода ускоряют появление плодоношения.

По сведениям З.Э. Беккер, приблизительно 17 – 18 минеральных элементов необходимы для основного обмена грибов.

Вих число входят макро- и микроэлементы, такие как сера, фосфор, калий, железо, медь, цинк, марганец, молибден, кальций.

Вэтих же работах указывается возможность потребности в кобальте, галлии, боре, скандии, ванадии (Беккер, 1963; Беккер,

1988).

Достоверно выявлено, что изменение компонентов питательной среды сказывается на накоплении минеральных веществ в мицелии. Так, количество золы в мицелии трутовика Fomes marginatus оказалось очень большим при выращивании его на неразбавленной среде Варена (Рипачек, 1967). Количество минеральной золы, встречающееся у грибов, колеблется в пределах от 6 до 12 % от массы сухого мицелия. В их зольном составе обычно преобладают фосфор и калий, меньше магния и железа. Так как потребность в минеральных компонентах питательной cреды складывается на основе преобладающих у данного вида путей метаболизма, состав основных компонентов золы может варьировать. Так, у дрожжей с преобладанием гликолитического пути обмена, связанного с переработкой углеводов через путь спиртового брожения, при слабом размножении клеток в составе золы обнаружено до 50% фосфора, который особенно необходим для этих процессов, и 25% калия. Однако у малоспособных к спиртовому брожению, но сильно разрастающихся гифообразных грибов наблюдается в золе обратное соотношение (Беккер, 1988). В остальных 25% от состава золы грибов в обоих случаях можно обнаружить до 50 различных элементов, обычно встречающихся в почве: марганец, железо, магний, цинк, медь, кальций (Добровольский, 2004). Фосфор, калий и сера составляют контингент самых важных неорганических компонентов обмена.

Данные о роли многих микроэлементов в процессах роста и метаболизма культур микроорганизмов представлены, в боль-

37

шинстве своем, общими сведениями. Обзор роли железа, магния, кальция, калия, а также целого ряда прочих микроэлементов свидетельствует, что исследования в этой области, касались, в основном, продуцентов антибиотиков. Микроэлементы Cu, Zn, Mn, Мо, Со также играют существенную роль в жизнедеятельности микроорганизмов, причем роль этих элементов в клеточном метаболизме ксилотрофных базидиомицетов велика и в достаточной степени изучена.

Названные элементы обладают высокой каталитической активностью в процессах внутриклеточного обмена. Их каталитическая активность возрастает в тысячи и миллионы раз в тех случаях, когда ионы металлов соединятся с молекулами органических веществ и образуют так называемые органоминеральные комплексы. Эти внутрикомплексные металлорганические соединения (хелаты) играют важную роль в реакциях фермент – субстрат.

Медь в сочетании со специфическими белками образует ряд ферментных систем. Представителями этой группы ферментов являются полифенолоксидазы и аскарбиноксидазы, нитратредуктаза, альдегидоксидаза и др. Особую значимость медь имеет для ксилотрофных безидиомицетов – грибов белой гнили, поскольку ионы меди входят в состав активных центров «голубых» оксидаз. В активный центр лакказ входят четыре иона меди, координированное взаимодействие которых приводит к сопряжению процесса одноэлектронного окисления субстратов – доноров с четырехэлектронной реакцией восстановления дикислорода (Горбачева и др., 2008). Установлено, что глубинная биомасса высших базидиальных грибов обладает значительным потенциалом для связывания ионов меди (Ровбель и др., 2004). Изучено влияние различных концентраций меди на накопление биомассы и синтез липидов у Pleurotus ostreatus. Добавление в среду ионов меди в низких концентрациях (1 мМ) способствовало, на фоне некоторого угнетения роста, интенсивному накоплению общих липидов, тогда как повышенное содержание элемента (5 мМ) приводило к резкому снижению обоих показателей (Николайчук и др., 2005). Различное действие низкой и высокой концентраций ионов меди на накопление общих липидов в мицелии может

38

быть обусловлено разной степенью ингибирования (или активирования) ионами меди ферментов, участвующих в синтезе липидов, а также изменением структуры мембран клеток (Демидчик и др., 2001).

Марганец входит в состав многих ферментных систем ксилотрофных базидиомицетов и, в первую очередь, в состав карбоксилаз. Он принимает, по-видимому, участие в синтезе протеиназ. Марганец входит также в состав фосфорилаз, которые участвуют в переносе фосфорной кислоты от аденозинтрифосфата. Фермент Mn-зависимая пероксидаза был выделен наряду с лигниназой из культуральной жидкости гриба

Phanerochaete chrisosporium (Kuwahara et al., 1984). Установле-

но, что фермент содержит гем и окисляет фенольные соединения в присутствии перекиси водорода. Однако из пероксидаз этот фермент отличается тем, что для проявления его активности необходимо присутствие в среде марганца (Harvey et al., 2001). Данный фермент способен регенерировать пероксид водорода, используя в качестве доноров протонов восстановленные глутатион и NADH (Asada et al., 1995). Обнаружено позитивное влияние ионов марганца на темпы формирования такой маркерной морфологической структуры как коричневая пленка

уLentinus edodes (Цивилева и др., 2006).

Вцелом, обзор данных о роли микроэлементов в процессах роста и метаболизма базидиомицетов, свидетельствует о том, что конкретная информация однобока и несколько ограничена. Ука-

зывается, что недостатком в среде минеральных элементов, в частности фосфатных и сульфатных ионов, К, Mg, ряда других микроэлементов (железа, цинка, марганца, меди, бора и молибдена) часто ингибируется плодоношение макромицетов в культуре. (Бухало, 1988). Определенный интерес, на наш взгляд, представляет исследование роли, в частности, в развитии культур древоразрушающих базидиомицетов, ряда эссенциальных элементов, таких как селен, германий. Факт повышенного содержания селена в плодовых телах базидиомицетов установлен и описан в литературе (Ермаков, Ковальский, 1979; Блинохватов, 1995). Наши исследования, проведенные в 19962002 гг. обнаружили интересные зависимости в реакциях на внесение соединений селена в питательные среды у быстро-

39