Ильина Г.В., Ильин Д.Ю. Ксилотрофные базидиомицеты в чистой культуре

роль способны сыграть региональные коллекции, представительство культур в которых формируется в основном из характерных для региона видов. Региональные особенности формируют параметры экосистем, что определяет спектр видов микобиоты, их характерные трофические связи (Гарибова, Ильина, 2009). На этом основании можно предполагать нахождение штаммов с уникальными свойствами, отличающими региональные образцы от таковых иного происхождения. Кроме того, нередко возникают ситуации, когда при составлении региональных Красных книг в статус редких попадают виды, для которых территория данного региона представляет собой либо границу ареала (что определяет пессимальные условия), либо их представительство носит экстразональный характер. Включение таких видов в состав коллекции для изучения их экологических особенностей не только в природных, но и в лабораторных условиях, позволит выяснить их истинный статус.

1.2Трофические потребности ксилотрофных базидиомицетов

вусловиях чистой культуры

Культуры базидиомицетов, выделенные из естественных мест обитания и культивируемые затем в лабораториях, попадают при этом, как правило, в несвойственные для них условия существования. В лабораториях большинство микроорганизмов поддерживается и изучается в виде чистых культур, то есть

втаком состоянии, в котором эти организмы природе никогда не встречаются. Развитие грибов в природном субстрате происходит зонами, микроколониями, в окружении организмов других видов. Многие клетки, споры вегетативного, бесполого и полового спороношения адсорбируются механическими частицами, находятся в иммобилизованном состоянии, обладая при этом свойствами, отличными от свободно живущих клеток. Отличие состоит также и в том, что при культивировании организмов

ввиде чистых культур исключается возможность влияния на них других организмов, не проявляется благоприятное или, наоборот, вредное действие продуктов жизнедеятельности других организмов, продуктов распада отмерших клеток других в и- дов. В условиях лабораторного культивирования микроорганизмы нередко попадают в исключительно благоприятные ус-

20

ловия питания; для них подбираются оптимальная температура развития, благоприятная для роста влажность, кислотность среды и другие факторы, которых организм обычно не имеет в естественных местах обитания.

Организмы, выделенные из природы и перенесенные в лабораторные условия, – это, по выражению Виноградского, «одомашненные, тепличные организмы» (Егоров, Самуилов, 1997;

Егоров, 1988).

При культивировании грибов в лабораториях обычно имеет место развитие их в ограниченном пространстве. Все это способствует тому, что физиологическая деятельность микроорганизмов, находящихся в условиях лабораторного культивирования, значительно отличается от их деятельности при развитии, например, на древесном субстрате.

Таким образом, при лабораторном культивировании микроорганизмов на проявление их физиолого-биохимического потенциала могут влиять совершенно иные факторы, другие закономерности по сравнению с теми, которые имеют место в природе. Условия, искусственно создаваемые для развития организмов, можно легко контролировать, что позволяет определять роль и влияние отдельных факторов на рост, развитие изучаемого микроба и проявление им различных биохимических, в том числе и продукционных свойств.

К числу наиболее существенных факторов, оказывающих влияние на проявление ценных свойств микроорганизмов, реализацию их природного потенциала относятся состав среды, концентрация протонов водорода, редокс-потенциал, температура культивирования, методы совместного выращивания двух или большего числа видов микроорганизмов и другие факторы, иными словами, весь сложный комплекс условий культивирования микроорганизмов. При этом к важнейшим факторам, определяющим активность гетеротрофных организмов, следует отнести, прежде всего, наличие в среде элементов питания. Оптимальный состав питательной среды для каждого продуцента (биомассы или вторичных метаболитов) или коллекционной культуры может быть определен двумя способами: эмпирический и построение математической модели с использованием пакетов компьютерных программ. Последний способ, как наиболее

21

объективный и статистически точный является более предпочтительным (Егоров, 1988). Основной принцип составления рецептур питательных сред – удовлетворение физиологических потребностей микроорганизмов. В каталогах культур и в определителях указаны эти потребности, а также оптимальные значения рН и температуры. Задача специалиста, оптимизирующего состав среды для конкретного штамма – продуцента целевого продукта,

– выбрать из перечня источников углерода, азота, фосфора и других веществ наиболее оправданные в экономическом и экологическом отношении компоненты. С этой целью проводят лабораторные опыты, желательно с использованием методов математического планирования эксперимента. Отдельным, не менее важным вопросом является разработка питательных сред для коллекционных культур. Здесь требуется, с учетом индивидуальных особенностей сохраняемых культур, не только создать соответствующие условия температуры и влажности, способствующие замедлению процессов метаболизма, но подобрать «пролонгированные» источники питательных веществ, компоненты которых должны обеспечивать защиту от окислительного стресса и обеспечивать существование живой культуры в течение длительного времени (Ильин, Ильина, 2003).

В питании базидиальных грибов главную роль играют соединения, содержащие углерод, так как служат двум основным функциям в метаболизме этих организмов: снабжают собственно углеродом, необходимым для синтеза веществ живых клеток и участвуют в процессах окисления, где являются единственным источником энергии (Курсанов, 1940; Шиврина, 1965). Благодаря различной химической природе, благодаря неодинаковой степени окисленности, разные источники углерода сами по себе также оказывают существенное влияние на развитие микроорганизмов и, следовательно, на образование ими метаболитов.

Наилучшим образом роль различных источников углерода в качестве компонентов питательной среды освещена в применении к продуцентам антибиотиков. При этом многими исследователями выявлено, что тот или иной источник углерода способен обеспечить нормальный рост микроорганизма, но подавляет синтез антибиотика, другие – наоборот. Например, при развитии Penicillium chrysogenum (продуцента пенициллина) лактоза ис-

22

пользуется организмом медленнее, чем глюкоза, и это сказывается на выходе антибиотика. Если в среде в качестве источника углерода присутствует только глюкоза, то все обменные процессы, осуществляемые грибом, ускоряются. В этих условиях максимум образования пенициллина происходит приблизительно через 50 ч развития культуры, вследствие чего уровень биосинтеза антибиотика остается низким. В присутствии же лактозы максимум образования антибиотика происходит через 150 – 160 ч и это способствует повышению выхода пенициллина. Поэтому на практике для получения пенициллина обычно используют одновременно и глюкозу и лактозу, что обеспечивает хорошее развитие гриба и высокий уровень биосинтеза пенициллина.

К сожалению, таких данных, отражающих результаты исследований по значению различных источников азота для культур ксилотрофных базидиомицетов относительно немного. Без сомнения, высшие базидиомицеты, представляющие собой различные экологические группы, в природе сталкиваются с большим разнообразием углеводов, чаще всего с полимерными формами простых сахаров. В монографии А.С. Бухало (1988) сделан обзор зарубежных и отечественных исследований по вопросу предпочтений высшими базидиомицетами различных источников углерода при искусственном культивировании. Все источники свидетельствуют, что высшие базидиомицеты в культуре предпочитают сахара другим источникам углерода. Существует мнение, что глюкоза является универсальным источником углерода для всех высших базидиомицетов, хотя она и не всегда обеспечивает максимальный рост мицелия. Для большинства этих грибов таким же хорошим источником углерода, как глюкоза, служит фруктоза (Шиврина и др., 1969; Berry, 1975). Многие дереворазрушающие грибы из пентоз хорошо используют ксилозу, в то время как арабиноза утилизируется ими очень слабо (Fries, 1955; Worgan, 1968; Berry, 1975). Для многих базидиомицетов из спиртов пригодны маннит и глицерин (Шиврина и др., 1969; Бухало и др., 1972; Маслова, 1973; Berry, 1975; Gupta, Pathak, 1982). Всеми высшими базидиомицетами из дисахаридов потребляются мальтоза и целлобиоза. Сахароза не является универсальным источником углерода для этих грибов, а лактоза используется наименьшим количеством исследованных

23

штаммов (Шиврина и др., 1969; Маслова, 1973; Johri, Brodie, 1972; Berry, 1975). Наилучшим источником углерода для ряда видов является крахмал (Fries, 1955; Worgan, 1968; Маслова,

1973; Sakamoto et al., 1978a, b). Для видов родов Tricholoma, Agaricus хорошим источником углерода служат пектиновые вещества, хуже усваиваются декстрины (Treschov, 1944; Fries, 1955; Worgan, 1968; Oyama et al., 1974).

Безусловную ценность представляют работы под руководством А.С. Бухало, посвященные изучению роли источника углерода при искусственном культивировании ксилотрофных базидиомицетов (1988). В качестве единственного источника углерода на синтетической среде были испытаны моносахариды – ксилоза, глюкоза, галактоза; дисахариды – сахароза, мальтоза, лактоза; трисахарид – рафиноза; полисахариды – крахмал, сахароза; спирт – маннит. Контролем служила питательная среда с глюкозой. Кроме того, в качестве источника углеродного питания были испытаны целлюлоза, лигнин и неуглеводные источники – мягкий парафин и этанол. Интенсивность роста исследованных видов, культивированных на питательных средах с разными источниками углерода, значительно отличалась. Так,

Panus tigrinus, Flammulina velutipes и Kuehneromyces mutabilis

лучше усваивали ксилозу по сравнению с глюкозой, однако большинство видов хуже росли на питательной среде с ксилозой. Глюкоза оказалась наилучшим источником углерода для

Armillaria mellea и Pholiota adiposa. Большее количество био-

массы на среде с галактозой, чем на среде с глюкозой, образо-

вывали Schizophyllum commune, Panus tigrinus, Coprinus comatus, Agaricus silvaticus и другие виды. Из испытанных ди-

сахаридов лучше использовалась мальтоза. Более активно, чем на других источниках углерода, на ней росли Schizophyllum commune, Panus tigrinus, Pholiota aurivella. Лактоза и рафиноза усваивались хуже, чем другие источники углерода. Многие ис-

пытанные виды – Kuehneromyces mutabilis, Panus tigrinus и дру-

гие глюкозе предпочитали крахмал (Бухало, 1988). Данные, полученные при культивировании Crinipellis schevczenkovii, свидетельствуют, что из 13 исследованных источников углерода (глюкоза, арабиноза, ксилоза, манноза, фруктоза, лактоза, мальтоза, сахароза, маннит, сорбит, крахмал, целлюлоза) лучшими

24

для роста гриба и синтеза им полисахаридов являются глюкоза и крахмал (Бабицкая и др., 2005).

Усвоение высшими базидиомицетами углеводородов в литературе освещено неполно. Т. Сугимори с соавторами (Sugimori et al., 1971) приводят данные об использовании высшими базидиомицетами, в том числе Pteurotus ostreatus, Flammuiina velutipes, Lentinus edodes и Schizophyllum commune,

неуглеводных источников углерода: алифатических спиртов, алканов, органических кислот трикарбонового цикла. На мягком парафине в качестве источника углерода растут Coriolus zonatus, Schizophyllum commune, Armillarieila mellea, Hirneola auricula-judae, Pholiota aurivella, Pleurotus ostreatus (Bilai et al.,

1968; Билай, Коваль, 1980; Бухало, 1988; Антоненко, 2009). Древоразрушающие базидиомицеты в природе принимают

участие в разложении целлюлозы и хорошо используют этот высокомолекулярный углевод при искусственном культивировании. Многие виды активно растут на среде с фильтровальной бумагой в качестве единственного источника углерода. К ним относятся лигнотрофние виды из родов Panus, Pieurotus, Flammulina, Pholiota и Schizophyllum (Бухало, 1988). Автор ци-

тируемой монографии свидетельствует, что наиболее высокой активностью целлюлозолитических ферментов характеризуются виды, приуроченные в природе к целлюлозосодержащим суб-

стратам: Panus tigrinus, Pleurotus ostreatus, Flammulina velutipes, Crinipellis schevczenkovi и Armillarieila mellea.

Лигнин используется грибами белой гнили в природе. Однако в культуре для усвоения грибами он должен находиться в доступной форме, и грибы, как правило, должны быть к нему адаптированы (Шиврина и др., 1969; Berry, 1975). Проблема такой адаптации, а также получения соответствующих форм лигнина мало освещена в литературе.

Особенности содержания тех или иных функциональных групп в различных видах лигнина довольно подробно освещены в целом ряде специальных монографий (Грушников, Елкин, 1973; Закис, 1987). В качестве примера, иллюстрирующего разнообразие функциональных групп в препарате, который принято считать наиболее близким к природному лигнину

25

еловой древесины, следует привести гипотетическую структурную формулу фрагмента макромолекулы лигнина Бьёркмана, предложенную Фрейденбергом (1969) (рис.2).

Рисунок 2 – Гипотетическая структурная формула фрагмента макромолекулы лигнина хвойной древесины (по

Freudenberg, 1968)

Схема эта, конечно же, не претендует на абсолютно точное отображение истинного строения макромолекулы лигнина, но наиболее удовлетворительно согласуется с аналитическими данными и позволяет объяснить многие реакции лигнина и его трофическую значимость для грибов белой гнили. Согласно формуле Фрейденберга, в природном (in situ) лигнине присутствуют следующие функциональные группы: метоксильные, фенольные гидроксильные, первичные и вторичные алифатические гидроксильные, кетонные и альдегидные (Азаров и др.,1999; Айзенштат, Боголицин, 2009). В других видах и препаратах лигнина количество групп будет иным. В зависимости от спо-

26

соба выделения и обработки препарата, особенно при химическом модифицировании, в нем могут появляться и другие, не свойственные природному лигнину группы.

Вопрос о том, является ли лигнин источником энергии для грибов, способен ли лигнин хотя бы отчасти обеспечивать энергетические и ростовые потребности этих организмов, является дискуссионным. По мнению Т.К. Кирка, лигнин не следует рассматривать как источник энергии, а его деструкция древоразрушающими грибами белой гнили является лишь частью вторичного метаболизма (Kirk, 1981). Существуют подобные обзоры, посвященные процессам биодеградации лигнина (Решетникова, 1997; Головлева, Леонтьевский, 1998; Eriksson et al., 1990; Hattaka, Vares, 1994). На основе существующих данных, выделяют следующие группы реакций, приводящих к деструкции макромолекулы лигнина:

- окисление боковых цепей лигнина по α- и β- углеродным атомам с образованием структур, содержащих кетогруппы,

атакже с образованием фенольных структур;

-гидролитическое расщепление β-О-4 эфирных связей с образованием спиртовых и фенольных структур;

-разрушение алкиларильных С-С-связей, образование n- хиноидных структур и альдегидных или кислотных фрагментов;

-деметилирование и гидроксилирование ароматического

кольца;

-расщепление ароматического кольца с образованием алифатических продуктов, чаще всего карбоновых кислот (Решетни-

кова, 1997).

Исходя из приведенных данных, следует предполагать включение углерода метоксильных и других групп в метаболические процессы грибов, способных к деструкции лигнина. Исходя из цитируемой многими литературными источниками связи процессов окисления лигнина с реакциями вторичного метаболизма, можно предполагать и наличие в определенной степени регуляторной роли со стороны лигнина и промежуточных соединений, образующихся в процессе его деструкции (вератровый спирт и т.п.).

27

Изменения в лигнине при деструкции грибами белой гнили изучали химическими методами, а также с помощью УФ-, ИК- и ПМР-спектроскопии с последующей качественной оценкой

(Fengel, Wegener, 1979; Dietrichs et al., 1995). Установлено, что под действием грибов белой гнили в лигнине увеличивается содержание карбонильных и карбоксильных групп и уменьшается содержание алифатических гидроксильных групп. Содержание фенольных гидроксилов может и возрастать и понижаться. Отношение кислорода к углероду увеличивается, а водорода к углероду и метоксильных групп к углероду понижается. Уменьшаются также выходы метоксилированных ароматических кислот при окислительной деструкции после метилирования (вератровой кислоты из хвойного лигнина и вератровой и три-О-метилгалловой кислот из лиственного лигнина) и продуктов нитробензольного окисления (ванилина из хвойного лигнина и суммы ванилина и сиреневого альдегида из лиственного лигнина). Уменьшается выход продуктов ацидолиза и их число. Из лигнина здоровой древесины в качестве основного продукта ацидолиза получается 3- гидрокси-1-(4-гидрокси-3-метоксифенил)-2-пропанон, тогда как из гнилого лигнина – ванилиновая кислота.

После воздействия грибов возрастает массовая доля кислорода и понижается содержание метоксильных групп (Фенгел, Вегенер, 1988). Увеличение содержания кислорода происходит в результате окисления α-углеродных атомов и окислительной деструкции связей между β- и γ-углеродными атомами пропановой цепи (Fengel, Wegener, 1979). Модельные опыты с различными метоксилированными фенолами показали, что грибы белой гнили деметилируют метоксильные группы. Опыты с меченым (14С) лигнином свидетельствуют, что при разложении лигнина грибами бе-

лой гнили (Coriolus versicolor, Phanerochaete chrysosporium) ко-

нечный продукт метаболизма СО2 образуется главным образом из метоксильных групп и в небольшой степени из углерода пропановых цепей и ароматических колец (Фенгел, Вегенер, 1988). Таким образом, практически не остается сомнений относительно включения функциональных групп лигнина в метаболические процессы грибов белой гнили.

Дальнейшие реакции приводят к получению мономерных и димерных соединений, большинство из которых содержат кар-

28

боксильные группы. Для включения этих соединений во внутренний обмен веществ гриба необходимо также, по-видимому, и расщепление ароматических колец. Среди ферментов грибов идентифицировали диоксигеназы, осуществляющие деметилирование ванилиновой и вератровой кислот – мономеров, которые были найдены в продуктах деструкции лигнина под действием грибов

(рис.3) (Chen et al., 1981).

Рисунок 3 – Окислительное расщепление ванилиновой кислоты под действием диоксигеназ

Расщепление ароматических колец возможно не только у мономерных продуктов деструкции. Ароматические кольца в лигнинном полимере также, по-видимому, расщепляются фермента-

ми (Kirk et al., 1976; Chen et al., 1981).

На расщепление ароматических колец указывают 13С-ЯМР- спектры искусственного лигнина, зараженного грибами белой гнили. Происходит также разрыв арилэфирных связей и расщепление пропановых цепей. Изменение состава продуктов ацидолиза древесины березы, пораженной белой гнилью, позволило заключить, что деструкция лигнина происходит на пораженной поверхности, которая прогрессирующе увеличивается. Макромолекулы практически не подвергаются фрагментации. Процесс деструкции заключается в отщеплении концевых групп (Фенгел, Веге-

нер, 1988).

Лигнин, очевидно, включается в метаболизм грибов не полностью, так как некоторая часть его превращается в высоко-

29