Ильина Г.В., Ильин Д.Ю. Ксилотрофные базидиомицеты в чистой культуре

Таблица 20 – Средние показатели яйценоскости кур родительского стада под влиянием мицелиальной добавки к рациону (р>0,05)

Таким образом, использование в качестве кормовой добавки сухого измельченного мицелия G. lucidum способствует повышению рентабельности производства яиц на стадии их получения и инкубации. Существенное снижение доли выбракованных яиц позволило увеличить объем инкубации почти на 10 %.

В ходе исследований были изучены также весовые показатели полученных в эксперименте яиц. Масса яиц была определена дважды: в начале периода эксперимента (30 марта) и в конце (12 апреля). При этом существенного влияния кормовой добавки на основе мицелия на показатели массы яиц обнаружено не было.

Биохимический анализ желтков яиц был проведен с целью определения показателей окислительного статуса, так как его показатели косвенно отражают жизнеспособность эмбриона. Для этого изучена активность глутатионпероксидазы и содержание малонового диальдегида в массе желтка (повторность анализа четырехкратная). Данные, полученные в результате анализа, свидетельствуют о достоверной стимуляции антиоксидантной системы мицелием G. lucidum, вводимым в основной рацион родительского стада. Так, если активность глутатионпероксидазы желтка в контрольном варианте составила в среднем 1801,0 мкмоль глутатиона/мин, то в опыте этот показатель был на уровне 4104,6 мкмоль глутатиона/мин. Таким образом, показатель возрос в 2,3 раза, что говорит о несомненном позитивном влиянии со стороны мицелиальной добавки (рис. 50).

180

Рисунок 50 – Влияние кормовой добавки на основе мицелия

G. lucidum к рациону птиц родительского стада на показатели окислительного статуса желтка: активность глутатионпероксидазы (ГПО) и содержание малонового диальдегида (МДА) (планки погрешностей – ошибка средней, р<0,05)

Не менее достоверные результаты получены при анализе желтка на содержание малонового диальдегида. Введение в рацион добавки мицелия позволило снизить названный показатель с 59,5 нмоль/мл до 24,1 нмоль/мл, то есть в 2,5 раза (см. рис. 50).

Важно, что результаты, полученные при определении двух различных маркеров окислительного статуса, обратно коррелируют между собой, что также свидетельствует в пользу их достоверности.

Для процесса инкубации было заложено по 120 яиц в контрольном и опытном вариантах. Инкубационные показатели, полученные при анализе состояния яиц, в целом, свидетельствуют о позитивном влиянии мицелия в качестве кормовой добавки (табл.

21).

181

Таблица 21 – Влияние добавки мицелия G. lucidum к рациону родительского стада на инкубационные показатели яиц

Таким образом, применяя добавку сухого измельченного мицелия G. lucidum к рациону кур родительского стада удалось повысить показатели вывода на 5,6 %. На наш взгляд, это тесно связано с процессом стимуляции антиоксидантной системы птиц, о чем свидетельствуют факты, приведенные выше. Подобный результат представляется ценным, поскольку позволяет существенно повысить рентабельность производства. Использование предложенной добавки рекомендовано к внедрению в практику птицеводства в сфере производства яиц и получения молодняка.

182

Заключение

Только экологические исследования, проводимые в природных условиях и параллельно в лабораторных, способны дать ключ для объективного решения целого ряда проблем и внести определенный вклад в теорию. Разнообразие представленных

вколлекции мицелиальных культур ФГБОУ ВПО «Пензенская ГСХА» видов по особенностям биологии, типам и локализации вызываемой гнили древесины и значительное штаммовое представительство каждого вида позволили выявить ряд ценных закономерностей в развитии сходных по некоторым параметрам групп. Для большинства из представленных в коллекции видов

влитературе показаны те или иные возможности их использования в биотехнологии (в качестве продуцентов биологически активных веществ: стеринов, пигментов, ферментов, антибиотиков и т.д.). В связи с этим, выявленные общебиологические закономерности, определяющие оптимальные приемы культивирования на основе ряда морфолого-физиологических характеристик видов, приобретают высокое практическое значение. В частности,

впрактике глубинного культивирования с целью получения биомассы мицелия, учет различных потребностей видов в обеспеченности культуральной жидкости растворенным кислородом способствует оптимизации процесса накопления биомассы и наиболее полной реализации продуктивного потенциала изолята. Выявлены закономерности формирования глубинных структур у афиллофороидных представителей ксилотрофных базидиомицетов. Повышенная потребность в кислороде обнаружена у видов, образующих in situ однолетние плодовые тела. Еще одним интересным моментом представляется обнаруженная связь между потребностью в кислороде и характером гнили древесины, отмечаемым для того или иного вида в природе. Так, повышенные концентрации кислорода зачастую определяли оптимизацию накопления биомассы у видов, для которых показана заболонная, либо сплошная гниль, а также гниль сердцевинного типа, распространяющаяся к периферии. Напротив, хорошо развиваются при

относительно низком содержании растворенного кислорода в среде виды, вызывающие только сердцевинную, реже сплошную гниль, а также гниль, распространяющуюся от периферии

183

кцентру. Изученные виды в пределах названных групп формируют тесные группировки при использовании кластерного анализа.

Культивирование видов с различными трофическими стратегиями позволило установить перспективы использования ряда эссенциальных факторов, оптимизирующих развитие культур. Указано, что относительно более полной реализации физиологического потенциала культур ксилотрофных базидиомицетов, прежде всего редких и ценных в биотехнологии видов, можно достичь использованием некоторых ростовых факторов, а также адаптогенов различной природы. Установлена эссенциальность парааминобензойной кислоты (ПАБК), применение которой сокращает продолжительность фазы адаптации к субстрату, что особенно ценно при культивировании видов с паразитическими стратегиями развития. Полученные данные свидетельствуют и о стимуляции обменных процессов у факультативных сапротрофов на этапе вовлечения в метаболизм труднодоступных источников углерода. В целом, полученные результаты подтверждают постулат о роли и месте ПАБК в метаболических процессах микроорганизмов, и, в частности, ксилотрофных базидиомицетов, как эссенциального ростового фактора (Овчинников,

1987).

Значительный блок исследований посвящен изучению роли соединений селена в практике культивирования и хранения ценных в биотехнологии штаммов ксилотрофных базидиомицетов. При исследовании влияния на ход развития культур неорганического (селенат натрия) и органического соединения селена (9- фенил-симметричный-октагидроселеноксантен) обнаружена, у представителей разных трофических группировок, неоднозначная реакция. Полученные на основе теста Дункана группировки распределяются таким образом, что виды, склонные к паразитной трофике в природных условиях, обнаруживают стимуляцию роста органической формой селена, а обладающие сапротрофной трофикой – неорганической. Общей тенденцией культур, развивающихся в присутствии соединений селена, является более ранний переход к фазе стационарного роста, при этом отмечается сокращение фазы адаптации (что особенно заметно на примере медленнорастущих культур облигатных паразитов), и некоторое сокращение фазы логарафмического роста. Фаза стационарного

184

роста несколько растягивается во времени и стабилизируется. У большинства изученных штаммов показатели темпов роста

вэтот период увеличиваются незначительно, по сравнению с контролем. Эффект синхронизации развития культуры на примере микромицетов – продуцентов антибиотиков отмечался нами ранее и описан в ряде работ (Ильина и др., 2000; Ильин и др., 2001). Возможно, в данном случае обнаруживается результат действия подобного механизма, то есть нивелируются факторы окислительного стресса, провоцирующие старение культуры. Использование соединений селена в практике хранения культур обеспечило сохранение последних в жизнеспособном состоянии в течение длительного периода, более стабильный, относительно контрольных показателей, антиоксидантный статус мицелия, что

всовокупности свидетельствуют о значительном нивелировании фактора окислительного стресса. Известно, что селен, как часть глутатионпероксидазы, оказывает защитное действие при окислительном стрессе, катализируя распад перекиси водорода или разложение гидроперекисей липидов и тем самым, прерывая переокислительную цепную реакцию свободных радикалов (Grossman and Wendel, 1983). Кроме того, в ряде литературных источников на соединения селена – селенаты – указывают как на антиметаболиты (Birkett and Rowlands, 1981). В данном случае имеет место стабилизация обменных процессов, на фоне которой замедление метаболических реакций влечет за собой торможение свободнорадикальных процессов. С фундаментальных позиций полученные результаты свидетельствуют в пользу общебиологической концепции роли селена в живых организмах. Такой способ хранения культур является авторской разработкой и запатентован (Патент№2185435, 2002).

Любые разработки в области биотехнологии предполагают

вкачестве обязательных этапов скрининг штаммов продуцентов того или иного продукта (биомассы или ценных метаболитов), а также периодическую верификацию самого продуцента. Открытие новых биологически активных веществ, продуцируемых высшими базидиальными грибами, в настоящий период идет нарастающими темпами. С этих позиций исследования, проводимые с целью разработки новых методов скрининга, становятся все более актуальными.

185

В ходе проведенных исследований предложен метод скрининга перспективных штаммов – продуцентов стеринов. Сродство эргостерина и некоторых ценных метаболитов стериновой природы и их производных (ганодеровые, ганодериковые кислоты и т.п.) свидетельствует о целесообразности подобных исследований. Метод основан на селекционном отборе штаммов, резистентных к воздействию полиенового макролида нистатина. Впервые установлены токсичные для базидиальных макромицетов концентрации названного полиена, установлены возможные пути адаптации к его действию у разных видов. Ряд этих адаптаций связан с интенсификацией синтеза эргостерина. Не исключено, что и в естественных условиях, аналогичный механизм (воздействие антибиотиков полиеновой природы, продуцируемых микроорганизмами, входящими в консорцию растениясубстрата), может выступать в качестве одного из факторов отбора штаммов ксилотрофных базидиомицетов, способных к реализации полного жизненного цикла (от базидиоспоры до базидиоспоры). Общебиологическое значение имеет показанная в работе связь динамики эргостерина в мицелии с протеканием морфогенетических процессов культур.

Особый интерес при проведении исследований представляло изучение роли и влияния на ход развития культуры со стороны компонентов природного субстрата дереворазрушающих грибов

– источников целлюлозы и лигнина. По мнению ряда авторов, лигнин, как компонент древесного субстрата, может влиять на морфогенез культуры в естественных условиях (Фенгел, 1988). Традиционно в практике грибоводства используются твердые органические лигноцеллюлозные субстраты, однако корригирующая и трофическая роль лигнина практически не исследована. Поскольку лигнин древесины на разных стадиях ее разложения характеризуется различной структурой, прежде всего, различной доступностью свободных метоксильных групп, в исследования были включены лигноцеллюлозные материалы с разной степенью конденсации молекулы лигнина и разным количеством доступных метоксильных групп. Выявлена связь между концентрацией метоксильных групп в субстрате и интенсивностью развития культур. Установлено, что активнее осваивают обогащенный метоксильными группами субстрат представители видов, чаще

186

встречающихся в природе на древесине высокой степени разложения, причем вне зависимости от типа вызываемой гнили. Вероятно, такие виды эволюционно адаптированы к эффективному использованию обилия метоксильных групп древесины, в значительной степени разрушенной. Путем обогащения метоксильными группами глубинных сред удалось повысить продукцию биомассы мицелия у большинства изученных видов грибов, возбудителей белой гнили древесины. Известные из литературы модельные опыты с различными метоксилированными фенолами показали, что грибы белой гнили деметилируют метоксильные группы (Maloney, 1978), а эксперименты с меченым (14С) лигнином свидетельствуют, что при разложении лигнина грибами белой гнили конечный продукт метаболизма СО2 образуется главным образом из метоксильных групп и в небольшой степени из углерода пропановых цепей и ароматических колец (Фенгел, Вегенер, 1988). Таким образом, достоверно показано: трофическая роль лигнина, включение метоксильных групп лигнина в метаболизм ксилотрофных базидиомицетов; а также целесообразность использования метоксилированных лигноцеллюлозных материалов в качестве компонентов питательных сред для дереворазрушающих базидиомицетов. В отношении корригирующей роли лигнина – обнаружена интенсификация процесса синтеза эргостерина культурами грибов белой гнили в присутствии в среде метоксилированного субстрата (экстракта лигнина). Установленная связь динамики этого метаболита в мицелии и морфогенеза культуры показала возможность стимуляции внесением лигноцеллюлозных, обогащенных метоксильными группами, материалов, процесса плодоношения у грибов указанной группы в условиях чистой культуры. Показаны возможности модификации разных сторон ферментативной активности мицелиальных культур путем обогащения среды такими компонентами.

С позиций биотехнологии важным и заслуживающим внимания моментом представляется обнаружение зависимостей между ростовыми характеристиками культуры и некоторыми сторонами ее ферментативной активности. Относительно быстрорастущие на агаризованных и твердофазных питательных субстратах штаммы грибов белой гнили, в среднем характеризуются более

187

высокой общей пероксидазной, а медленнорастущие – более выраженной общей оксидазной активностью. С фундаментальных позиций обнаруженные факты свидетельствуют о параллельном существовании различных эколого-биохимических стратегий, причем реализуемых на внутривидовом уровне. С практических же позиций, обнаруженные закономерности, с определенными долями вероятности, можно использовать при скрининге штаммов – перспективных продуцентов ферментов.

Верификация вида продуцента возможна в основном при наличии плодового тела. Использование в качестве компонентов питательного субстрата лигноцеллюлозных источников, обогащенных метоксильными группами, обеспечило возможность получения телеоморфы у изученных грибов белой гнили. О триггерной роли указанных компонентов лигнина в процессе морфогенеза базидиом свидетельствует тот факт, что примордии и зрелые базидиомы на стерильной среде у большинства видов удалось получить лишь при использовании метоксильных групп лигнина. На основе полученных данных разработана и запатентована лабораторно-промышленная технология получения типичных базидиом одного из наиболее перспективных в биотехнологии видов ксилотрофных базидиомицетов – Ganoderma lucidum (Патент №9773126, 2011). Технология позволяет одновременно решить целый ряд актуальных задач: биоконверсию отходов растениеводства и лесоперерабатывающей промышленности, получение плодовых тел G. lucidum – ценного фармацевтического сырья, а также получение массы отработанного вегетативного мицелия на гидролизованном органическом носителе, пригодного для приготовления на его основе кормовой добавки к рационам сельскохозяйственных животных. Разработанная добавка апробирована в условиях предприятия, освидетельствована актом комиссионного испытания и рекомендована к внедрению.

Таким образом, совокупность проведенных исследований позволила раскрыть некоторые перспективные стороны физиологического потенциала природных изолятов ксилотрофных базидиомицетов. Установленные факты и закономерности, полученные с использованием большого объема экспериментального материала, представляют интерес, как с теоретических, так и прикладных позиций.

188

ЛИТЕРАТУРА

1.Автономова, А.В. Оптимизация состава питательной среды для погружённого культивирования Ganoderma lucidum (Curt.:Fr.)P. Karst / А.В.Автономова, Л.М.Краснопольская, В.Н. Максимов // Микробиология.–2006. – Т.75 – №2. – С. 186–192.

2.Автономова, А.В. Противоопухолевые и иммуномодулирующие свойства гриба бессмертия Ganoderma lucidum / А.В Автономова, Л.М Краснопольская // Нетрадиционные природные ресурсы, инновационные технологии и продукты.–М., 2007. 216–224 с.

3.Азаров, В.И. Химия древесины и синтетических полимеров/ В.И Азаров, А.В Буров, А.В Аболенская.–С.-Пб., 1999. 628 с.

4.Айзенштадт, М.А. Пероксидазное окисление лигнина и его модельных соединений / М.А Айзенштадт, К.Г Боголицын // Химия растительного сырья.–2009.–№2.–С.5–18.

5.Александрова, Г.П. Влияние состава питательной среды на лигниназную активность базидиомицета Phanerochaete crysosporium /Г.П Александрова, С.А Медведева, В.А Бабкин, В.А. Соловьёв, О.И Малышева, С.З Иванова // Химия древеси- ны.–1989.–№6.–С.77–80.

6.Александрова, Г.П. Биоотбелка сульфатной целлюлозы оксидазными ферментами гриба Daedaleopsis confragosa / Г.П Александрова, С.А Медведева.// Химия растительного сырья.– 1999.–№2.–С. 81–84.

7.Андреева, В.А. Фермент пероксидаза: участие в защитном механизме растений/ В.А. Андреева.– М.,1988.–128 с.

8.Антоненко, Л.А. Отбор культур базидиальных грибов Coriolus zonatus (Trametes zonatus) на жидких питательных средах / Л.А.Антоненко, И.Р.Клечак, О.И Нишпорская // Иммунопатология, аллергология, инфектология.–2009.–№ 2–С. 159.

9.Ахмедова, З.Р. Биодеградация растительных отходов грибом Pleurotus ostreatus/ З.Р. Ахмедова // Биотехнология.-1992.-№ 3.-С.109–115.

189