Ильина Г.В., Ильин Д.Ю. Ксилотрофные базидиомицеты в чистой культуре

Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

уровне, что косвенно свидетельствует о наличии окислительного стресса.

При анализе результатов, полученных при определении содержания МДА в образцах мицелия, хранящихся на средах, с добавлением соединений селена (10-4 в пересчете на элемент), сравнение проводили с показателями, отмеченными в исходных образцах на стадии логарифмического роста. Содержание МДА в хранящемся мицелии штаммов обоих изученных видов, существенно различающихся трофическими особенностями в природных условиях, достоверно ниже контрольных показателей мицелия аналогичного возраста и срока хранения (рис. 18).

Рисунок 18 – Динамика содержания малонового диальдегида (МДА) в образцах мицелия G. lucidum (на примере штамма Gl-3) при продолжительном хранении на различных средах: контроль – КГА; опыт 1 – КГА, обогащенный Na2SeO4; опыт 2 – КГА, обогащенный 9-фенил-симметричным-октагидроселеноксанте- ном (вещества добавлены в концентрации 10-4 г/л среды в пересчете на селен)

Сохранение культур в жизнеспособном состоянии в течение длительного периода хранения, более стабильный, относительно

120

контрольных показателей, антиоксидантный статус мицелия, в совокупности свидетельствуют о значительном нивелировании фактора окислительного стресса.

Известно, что селен, как часть глутатионпероксидазы, оказывает защитное действие при окислительном стрессе, катализируя распад перекиси водорода или разложение гидроперекисей липидов и тем самым, прерывая переокислительную цепную реакцию свободных радикалов (Grossman and Wendel, 1983). Кроме того, вряде источников на соединения селена – селенаты – указывают как на антиметаболиты (Birkett and Rowlands, 1981). Органические же соединения селена в плане воздействия на рост и метаболизм, в частности, грибных культур, изучены сравнительно недостаточно. Возможно, в данном случае имеет место стабилизация обменных процессов, на фоне которой замедление метаболических реакций определяет торможение свободнорадикальных процессов. Это предположение вполне согласуется с полученными данными по стимуляции (в сравнении с контролем) развития мицелия в период адаптации к субстрату, то есть в фазу, сопровождающуюся адаптационным стрессом.

Полученные результаты однозначно свидетельствуют о целесообразности использования соединений селена в практике хранения культур ксилотрофных базидиомицетов.

121

Глава 5 АДАПТАЦИЯ НЕКОТОРЫХ ВИДОВ КСИЛОТРОФНЫХ БАЗИДИОМИЦЕТОВ К ВОЗДЕЙСТВИЮ ПОЛИЕНОВОГО МАКРОЛИДА НИСТАТИНА

Эргостерин является наиболее распространенным стерином у грибов и входит в состав клеточных мембран. Этот компонент мембран является своеобразной биохимической мишенью для повреждающего действия полиеновых макролидов, в том числе нистатина. Эргостерин полностью соответствует структуре мишени для полиенов.

В литературе имеются сведения об изменении состава стеринов в клетках дрожжей и мицелиальных грибов, которые приобрели устойчивость к полиенам как под действием мутагенов, так и в процессе адаптаций. Сообщается о трех типах изменений клеточных стеринов, обеспечивающих такую устойчивость, однако, как указывалось в разделе 1.3, нет единого мнения относительно механизмов полиенрезистентности. Вероятно одновременное существование различных систем адаптации. Кроме того, информация о современных исследованиях, посвященных данному вопросу, встречается крайне редко, и ориентирована на несколько иные стороны проблемы стеринового обмена грибов. В то же время полиеновые макролиды, и в том числе нистатин, обладающие значительной токсичностью, в настоящее время ограничены в применении и теряют актуальность как терапевтические средства, что может служить одной из причин некоторого ослабления интереса к ним и с позиций фундаментальных исследований.

5.1 Особенности толерантных к действию токсичных концентраций нистатина штаммов Ganoderma lucidum

В качестве объектов исследования нами использованы несколько штаммов G. lucidum. Это тканевые изоляты, выделенные из базидиом Gl-1, Gl-3, Gl-6; а также штаммы, полученные нами в лабораторных условиях (споровые изоляты). В ходе реализации интенсивной технологии культивирования нами неоднократно были получены экземпляры типичных плодовых тел G. lucidum.

122

При каждом плодоношении базидиоспоры собирали в асептических условиях, после чего с ними проводили исследовательские работы: изучение микроморфологии, проращивание методом высева спорового порошка в высокой степени разведения физиологическим раствором на питательные среды. В результате были получены монокариотические и дикариотические штаммы G. lucidum. Для исследований, связанных с выполнением данной работы, из них было отобрано, кроме указанных выше тканевых изолятов, три дикариотических штамма: GD-I-1, GD-I-2, GD-I-4. Предварительно были проведены исследования по установлению концентрации нистатина, лимитирующей развитие изученных штаммов G. lucidum. Установлено, что такой концентрацией является 120 ЕД/мл. Условно указанные выше штаммы названы полиенчувствительными.

Кроме названных мицелиальных культур, выделенных тканевым и споровым способом, в исследования были взяты два дикариотических штамма спорового происхождения, выращенные на средах, содержащих полиеновый макролид нистатин (в дальнейшем, полиенрезистентные штаммы). Для получения полиенрезистентных штаммов, на питательные среды (сусло-агар), содержащие указанную дозу выше нистатина, высевали споровый порошок, затем наблюдали прорастание спор и рост мицелия. Прорастание было отмечено только в 10% инокулированных чашек, тогда как в контроле (среда без нистатина), это значение составило 100%. Мицелий, развивающийся на среде с нистатином, характеризовался высокой плотностью, ярко-белой окраской и крайне медленными, хотя и отличными друг от друга, темпами роста. Таким образом, получены пять полиенрезистентных штаммов G. lucidum: GD-II–ун1, GD-II–ун2, GD-II–ун3, GD-II–

ун4, GD-II–ун5.

В одном случае, при развитии штамма GD-II–ун2, после относительно медленного освоения мицелием половины питательной среды, было отмечено формирование своеобразного валика по периметру колонии, затем темпы роста мицелия заметно возросли, и оставшийся субстрат был освоен вдвое быстрее, чем первая его часть. Валик и более старая часть колонии приобрели кожистую структуру и характерный темный пигмент (рис. 19).

123

Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Рисунок 19 – Развитие полиенрезистентного штамма GD II-ун2 G. lucidum на сусло-агаре, содержащем 120 ЕД/мл нистатина (стрелкой указан мицелиальный валик)

Это можно объяснить постепенной активацией адаптационных биохимических механизмов, позволяющих противостоять воздействию высоких доз нистатина. После полного освоения колониями питательной среды части мицелия были отвиты в пробирки со скошенным сусло-агаром без добавления нистатина.

Впоследствии был произведен рассев всех включенных

висследование штаммов G. lucidum на чашки Петри на суслоагар, в трех повторениях для выращивания одновозрастного мицелия. После полного освоения среды мицелиальные пленки аккуратно снимали и высушивали на воздухе. Определение содержания эргостерина в мицелии проводили газохроматографическим методом с дериватизацией в триметилсилильные производные.

Результаты исследований выявили существенные различия

всодержании эргостерина даже между обычными (полиенчувствительными) штаммами G. lucidum в 1,3 – 2,1 раза. При этом максимальное содержание эргостерина обнаружено в мицелии штамма Gl-1, который характеризуется повышенной склонностью к плодоношению в чистой культуре. Этот факт косвенно

124

свидетельствует о связи синтеза эргостерина с процессом плодоношения. Высокие показатели получены и при исследовании штамма спорового происхождения GD-I-4. Однако показатели содержания эргостерина, определенные в мицелии полиенрезистентных штаммов G. lucidum достоверно превышают как индивидуальные, так и средние показатели, характерные для прочих штаммов (табл. 10, рис. 20).

Таблица 10 – Показатели содержания эргостерина в мицелии различных штаммов G. lucidum

*полиенрезистентные штаммы; прочие – полиенчувствительные

Результаты свидетельствуют, что средние показатели содержания эргостерина в мицелии изученных полиенрезистентных штаммов превышают таковые обычных штаммов, в 2,4 раза (р<0,05). При многократном пересеве штаммов GD-II–ун1 и GDII–ун2 (устойчивых к нистатину) на среды, не содержащие нистатина, показатели содержания эргостерина несколько снижаются, но остаются достоверно более высокими. Все это делает состоятельной гипотезу о реализации у данного вида одного из предполагаемых механизмов устойчивости к повреждающему действию полиена. Важно отметить, что все выделенные полиенрезистентные штаммы G. lucidum, впоследствии проявили повышенную склонность к плодоношению в чистой культуре.

125

Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

В целом, практически для всех полиенрезистентных штаммов данного вида характерной особенностью является выраженная тенденция к образованию телеоморфы в условиях чистой культуры. Впервые на примере этих штаммов для нашей коллекции описано формирование развитых дифференцированных примордиев, имеющих типичную для вида структуру, на стерильном субстрате (сусло-агар) в чашках Петри и пробирках в довольно короткие сроки (9-12 суток от момента посева) (рис. 21). Это служит очередным подтверждением связи интенсивности синтеза эргостерина грибами с процессами плодообразования у базидиомицетов.

В целом, образование зачатков плодовых тел (примордиев) после хранения культуры в течение 2-3 недель, отмечено у всех без исключения штаммов, в мицелии которых обнаружено повышенное относительно средних показателей содержание эргосте-

рина (Gl-1, GD-I-1, GD-I-4).

126

Рисунок 21 – Формирование примордиев полиенрезистентными штаммами на стерильных средах: слева штамм GD II-ун1, справа штамм GD II-ун2

На разных стадиях развития культуры содержание эргостерина в мицелии изменяется. Так, установлено, что содержание эргостерина как у обычных, так и у полиенрезистентных штаммов снижается к окончанию фазы логарифмического роста (12-15 сутки), а затем несколько увеличивается при образовании анаморф (18-21 сутки), а также при образовании примордиев (рис.

22).

Рисунок 22 – Динамика содержания эргостерина в мицелии штаммов G. lucidum на разных этапах развития культуры (р<0,05, планки погрешностей – ошибка средней)

Важно отметить, что определенное после плодоношения некоторых штаммов содержание эргостерина в плодовых телах достоверно ниже, чем в вегетативных мицелиях и зачатках плодовых тел. Однако поскольку получены зрелые плодовые тела не

127

у всех изученных культур, сравнения в данном случае невозможно.

Установленные закономерности вновь свидетельствуют о сопряженности морфогенетических процессов и биосинтеза эргостерина у базидиомицетов.

Наблюдения за развитием полиенрезистентных штаммов на плотных агаризованных средах позволило обнаружить характерную последовательность событий. На первом этапе, непосредственно после посева, развивается типичный для вида дикариотичный вегетативный мицелий, характеризующийся более или менее выраженными плотностью и белизной, который можно рассматривать как «первичный».

После полного освоения «первичным» мицелием площади питательной среды, поверх образовывается желтоватая бархатистая корочка, микроскопическое исследование материала которой выявило присутствие большого количества артроспор. Поверх корочки локально, как показали исследования, именно из артроспор прорастает «вторичный» белый мицелий, формирующий плотные островки. Впоследствии на этих островках начинается формирование зачатков плодовых тел (рис. 23 а)-в)).

Были проведены исследования по определению содержания эргостерина в разных частях мицелия: в белом «первичном», бархатистой желтой корочке, «вторичном» мицелии и самих примордиях. Полученные результаты свидетельствуют в пользу озвученного выше предположения о сопряженности морфогенети-

128

ческих процессов и интенсивности биосинтеза эргостерина у изученного вида (рис. 24).

Рисунок 24 – Содержание эргостерина в разных частях мицелия колоний G. lucidum (р<0,05, планки погрешностей – ошибка средней)

5.2 Особенности толерантных к действию токсичных концентраций нистатина штаммов Pleurotus ostreatus

В качестве объектов настоящего исследования нами использованы несколько штаммов P. ostreatus, выделенные из базидиом в разные годы, а также штаммы данного вида, полученные нами в лабораторных условиях (споровые изоляты). Изучено четыре штамма P. ostreatus: ПН-10, PlО(K)-05 (тканевые изоляты); PlО-I- 09 PlО-I-10 (споровые изоляты). Предварительно были проведены исследования по установлению концентрации нистатина, лимитирующей развитие штаммов изученных видов. Установлено, что такой концентрацией является 120 ЕД/мл. Условно указанные выше штаммы названы полиенчувствительными. Кроме названных мицелиальных культур, выделенных тканевым и споровым способом, в исследования были взяты пять штаммов изученного вида, названных нами полиенрезистентными. Это споровые изоляты, проращенные из базидиоспор на средах, содержащих полиеновый макролид нистатин в токсичной концентрации. Прорастание спор P. ostreatus отмечено лишь в 5% чашек. Культураль- но-морфологические признаки мицелия полиенрезистентных штаммов изученных видов различались, как и особенности роста.

129