Почвенная микробиология / Іутинська Г.О. Ґрунтова мікробіологія

ючому стані у ґрунтовому розчині, можуть бути адгезовані на поверхні ґрунтових часточок і занурені в органомінеральний гель, який покриває ці часточки. Гіфи грибів і стрептоміцетів можуть пронизувати ґрунтові часточки наскрізь. Як показали дослідження Т.В. Аристовської, у підзо­ листих ґрунтах комплекси гумусових кислот з полуторними окислами металів накопичуються у ґрунті у вигляді гелів, плівки яких покривають поверхню ґрунтових часточок і використовуються мікроорганізмами як поживний субстрат.

Чисельність мікроорганізмів, що виявляється прямими методами, набагато більша, ніж у посівах на поживних середовищах. Крім того, прямі методи дозволили виявляти рідкісні у морфологічному відношенні оліготрофні мікроорганізми - стебельчасті, нитчасті, спірально вигнуті, Зіркоподібні (рис. 5.2).

Рис. 5.2 Морфологія деякихоліготрофних (дисипотрофних) мііфоорганізмів (заД.І. Ніютіним, 1978р.)

61

Особливо велика кількість їх у ґрунті виявляється на кінцевих ста­ діях розкладу органічних решток. У лабораторних умовах ці мікрооргані­ зми культивуються на “голодних" середовищах із низьким вмістом (слі­ дові кількості) поживних речовин, швидкість їх росту мала. Ці мікроорга­ нізми відносять до оліпотрофних (дисилотрофних).

Вивчення просторового горизонтального розподілу мікроорганізмів підтвердило його неоднорідність. В одному шарі ґрунту поряд із густо заселеними педоскопами з численними і різноманітними за складом угрупованнями зустрічаються педоскопи з мізерним обростанням одно­ манітною мікробіотою. Вертикальний розподіл у цілинному ґрунті харак­ теризується найбільш щільним заселенням мікроорганізмами верхніх шарів; в орних ґрунтах розподіл мікроорганізмів значною мірою зале­ жить від способу обробітку. При щорічній оранці з обертанням скиби вертикальна диференціація орного шару зменшується і розподіл мікро­ організмів стає дещ о однотиповим. При мінімальному обробітку ґрунту на глибину не більше 3 -5 см просторова структура мікробних угрупо­ вань наближується до цілинних ґрунтів.

5.5. Таксономічна структура мікробних угруповань

Таксономічна структура мікробного угруповання характеризу­ ється кількістю і співвідношенням мікроорганізмів певних видів, родів або класів, що входять до його складу. Специфіка таксономічного складу мікробних угруповань ґрунтів різних кліматичних зон була вияв­ лена в роботах С.О. Сєвєріна, М.М. Лазарєва, М.О. Красильникова.

Теоретичне узагальнення закономірностей розповсюдження мікро­ організмів у ґрунтах зробив Є.М. Мішустін, сформулювавши теорію географічної зональності розповсюдження мікроорганізмів, згідно з якою географічний фактор має вирішальне значення для ґрунтотворення і специфічно впливає на формування мікробних ценозів ґрунтів. Тео­ рія Є.М. Мішустіна співзвучна сформульованому В.В. Докучаєвим зако­ ну зональності природи, суть якого полягає у тому, що ґрунтоутворювачі (рослини) розповсюджені на земній кулі зонами (як за широтою, так І за довготою) у зв'язку з астрономічним положенням Землі та її обертанням навколо своєї осі.

Є.М. Мішустін розробив теорію геграфічної зональності розповсю­ дження мікроорганізмів на основі узагальнення великої кількості мікробіологічих аналізів ґрунтів різних типів, зразки яких відбирали у числен­

62

них експедиціях на крайню Північ, у Лісостеп і Стел. Виявилося, що при переміщенні з півночі на південь (від підзолистих до чорноземних, каш­ танових і сіроземних ґрунтів) зростає чисельність мікроорганізмів і від­ бувається зміна домінуючих видів. На півночі в підзолистих ґрунтах пе­ реважають мікрококи і неслороутворюючі бактерії (частіше представники родів Achromobacter, Pseudomonas). Спороутворюючі бактерії зустріча­ ються в незначній кількості, серед них переважають Bacillus agglomera­ tus, В.cereus, B.mycoides. Чисельність актиноміцетів невелика, вони вияв­ ляються, в основному, у кореневій зоні рослин або удобреному екскре­ ментами тварин ґрунті і представлені, переважно видами Strepomyces albus, S.griseus, S.candidus. Чисельність мікроскопічих грибів у фунтах Півночі також невелика, переважають представники родів РепісіШит, Dematium.

У ґрунтах, що знаходяться південніше (чорноземи, темно-каштанові ґрунти), чисельність мікроорганізмів зростає у порівнянні з північними, при цьому у складі мікробних угруповань відносна кількість неспороутворюючих бактерій зменшується, а спороутворюючих - збільшується. У видовому складі останніх домінують Bacillus megaterium, B.idosus, B. subtiUs. Чисельність стрептоміцетів у південних фунтах більша у порі­ внянні з північними. У чорноземах європейських степів частіше всього зустрічаються представники груп Albus, Rubru-aurantiacus, Olivaceus, Chmmogenes, Flavus, Lavendulae. Стосовно мікроміцетів для південних ґрунтів відмічається тенденція зменшення загальної чисельності при збільшенні їх видового різноманіття. В мікобіоті південних фунтів пере­ важають представники родів РепісіШит, Mucor, Fusarium, Trichoderma.

Еколого-географічний напрямок досліджень ґрунтової мікробіоти у нинішній час розвивається з використанням сучасної систематики ар­ хей, еубактерій, грибів. Зокрема, І.Ю. Черновим проведено вивчення географічного розповсюдження дріжджів у ґрунтах різних типів І різних кліматичних зон. Встановлено, що та» види, як Criptococcus ІаигепШ, C. albidus, є еврібіонтними, тобто їх можна виділити з ґрунтів будь-якого типу. В той же час є веди, які мають тільки певний ареал розповсю­ дження, наприклад, Criptococcus gilvescens можна виділити лише з ґру­ нтів тундрової зони. Широтно-зональні зміни таксономічного складу мікобіоти проявляються також у різній частоті виявлення певних ведів.

Важливою характеристикою мікробного угруповання є чисельність ведів, які входять до його складу. Ємність екосистеми - це її здат­ ність створювати умови існування для популяцій різних видів. Чим більше ведів існують у даній екосистемі - тим більша її ємність. Для ха-

63

ракгеристики видового різноманіття (біорізноманіття) мікробних угрупо­ вань використовують такі екологічні характеристики:

Індекс видового багатства Сімпсона ОД:

с/, = (Б -1 )/ Ід N.

де 5 - число видів; N - число особин.

Індекс видового багатства Менхініка ОД):

<*М= 5 Л /Л /,

де в - кількість виявлених видів; ЛГзагальна кількість особин.

Індекс домінування Бергвра-Паркера О Д;

до /Чпа*- кількість особин найбільш чисельного виду; N - загальна чи­ сельність виділених видів.

Індекс різноманіття Шеннона (Н):

И

Н/= - £Р(0Іод2 Р (і),

Н,= -ІР (І)Ю д гР(І),

де Р(і) - імовірність значущості для кожного виду виявлення у просторі та у часі. Просторова частота виявлення (і) - це відношення числа зраз­ ків, у яких вид був виявлений до загального числа досліджених зразків. Частота виявлення у часі (І) - це відношення числа моментів часу, коли вид був виявлений до загального числа моментів відбору зразків. Сумі­ сне використання показників частоти виявлення у просторі і у часі дає можливість диференціювати роди і види на такі категорії:

•домінуючі, для яких обидва індекси мають значення > 50%;

•типові, для яких обидва індекси мають значення > 30%;

•рідкі, для яких індекс Нгмає значення >30%, а Н , < 30%;

•випадкові, для яких обидва індекси мають значення < 30%.

Коефіцієнт подібності Ссрвнсвна ($):

5=2С/(А+В),

де А - сума частот виявлення певного виду у зразках ґрунту з першого об’єкта; В - сума частот виявлення цього ж виду у зразках ґрунту з дру­ гого об'єкта; С - сума частот виявлення видів, однакових для першого і другого об'єктів.

64

У сучасній ґрунтовій мікробіології для характеристики таксономічної структури мікробних угруповань використовують статистичні і матема­ тичні методи. В.М. Борисова для виявлення в певних біогеоценозах ха­ рактерних груп гіфоміцетів використала статистичний метод кореляцій­ них плеяд. Вперше цей метод був застосований П.В. Терентьєвим у та­ ксономічному аналізі для виявлення корелюючих і некорелюючих ознак біологічних об’єктів. Цей метод полягає в тому, що на основі розрахунків парних кореляцій між видами (або їх ознаками) виявляють групи, які пов'язані між собою тісними кореляційними зв'язками і формують певну структуру цих зв’язків. В.М. Борисова використала цей метод для аналі­ зу таксономічного різноманіття гіфоміцетів у різних за віком насаджен­ нях бука. Було виявлено, що у ґрунті під багаторічними насадженнями буку (40 років) формується 4-членна плеяда з таких родів:

1 - ЕгкіорЬгадтіа; 2 - РвпіаШит; 3 - ^рїіуІоігісЬит ; 4 - Неіісозропит

Ця плеяда є міцною, оскільки кожен з ЇЇ членів пов'язаний з іншими трьома зв’язками.

У лісах меншого строку насаджень (20 років) форма плеяди зміню­ ється на трикутник, який утворений такими родами: 5 - Уегіісісіасііит; 6 - їїасЬуЬоігуз; 7 - ТгісЬсЛЬесіит. Ця плеяда має меншу міцність, тому що розрив хоча б одного зв’язку веде до руйнування усієї плеяди.

При проведенні вирубки лісів плеяди у ґрунті взагалі відсутні, а в під­ стилці відмічається простий лінійний зв’язок між родами: 8 - ОгесЛв/ега;

9 - ЗоуіаМит:

65

о --------- о

в9

Таким чином, міцні плеяди зв'язків характерні для мікобіоти клімаксних систем або для біогеоцвкозів у непорушеному стані.

Завдяки тому, що фунт є місцеіснуванкям численних видів мікро­ організмів, він відіграв важливу роль у збереженні біорізноманіття мікробіоти. Наведені вище дані стосовно видового складу прокаріотів і грибів у ґрунтах різних типів були отримані традиційним методом посіву ґрун­ тової суспензії на поживні середовища з наступним виділенням чистих культур мікроорганізмів і визначенням їх таксономічного положення за морфологічними І фізіологічними ознаками.

У сучасній екологічній літературі одним із найактуальніших є питан­ ня збереження видового різноманіття природи, існує міжнародна про­ грама зі збереження біорізноманіття. Важливою складовою цієї про­ грами є збереження біорізноманіття мікробіоти ґрунту. Угруповання з високим видовим багатством є більш стійким до змін умов існування, тому що воно може реагувати на ці зміни більш різноманітними спосо­ бами, порівняно з угрупованням з малим числом видів.

Основною перешкодою у вивченні видового різноманіття мікроор­ ганізмів є те, що дослідник має справу з частиною угруповання. Дані стосовно видового складу прокаріотів і грибів у різних середовищах пе­ реважно були отримані традиційними методами виділення чистих куль­ тур і визначенням їх таксономічного положення. Проте далеко не всі мікроорганізми культивуються на штучних середовищах. У 1956 р. гол­ ландський дослідник А. КлюЙвер передбачив, що половина існуючої на Землі живої протоплазми належить клітинам мікроорганізмів. На сучас­ ному етапі ця гіпотеза отримала експериментальне підтвердження. Ви­ користання молекулярних методів досліджень показало, що кількість виділених чистих культур мікроорганізмів у відношенні до їх чисельності у природі становить менше 0,1%. Були проведені підрахунки, згідно з якими за умов Існуючої швидкості відкриття і опису нових видів усі рос­ лини І тварини будуть описані протягом найближчих 50 років, тоді як на опис усіх видів мікроорганізмів знадобиться 10 000 років.

Останнім часом усе більш популярними є методи вивчення біоріз­ номаніття мікробного населення ґрунту без виділення чистих культур мікроорганізмів. Зокрема, використовують метод мультисубстратного тестування для визначення метаболічного потенціалу угруповань. Суть цього методу полягає у тому, що на планшеті в окремі лунки нанесені різні поживні субстрати: вуглеводи, ліпіди, білкові субстрати, а також

66

тест на дихання з використаним люмінесцентних солей тетразолію. У кожну лунку вносять водну суспензію ґрунту. Якщо угруповання рІЗ' кяться за фізіологічними властивостями, то вони будуть метаболізувати різні поживні субстрати, що дасть певну картину засвоєння нанесених у лунки субстратів.

Інтенсивно розвивається молекулярна екологія, яка базується на принципі вивчення біорізноманіття мікроорганізмів із застосуванням аналізу окремих елементів їх генетичного матеріалу. Найбільш пошире­ ним є експериментальний підхід рибосомної філогенетики, яка вивчає філогенетичні характеристики мікроорганізмів шляхом порівняння пер­ винної структури послідовностей рибосомиих генів або їхніх продуктів - рибосомальної РНК (рРНК). Найбільш поширеним маркером є ген РНК малої субодиниці рибосоми - Іб Б гЯІМА (рРНК). Застосування рибосом­ ної філогенетики для вивчення мікробних угруповань базується на тому припущенні, що кожний член угруповання має свій унікальний тип послі­ довностей гена 168 гіЗДА (168 гШ А ).

При вивченні угруповання не на рівні окремих цілих клітин, а на рів­ ні елементів № геномів був запропонований термін філотип, який озна­ чає специфічну послідовність генів для окремого члена мікробного угру­ повання. Визначення присутності філотипу не залежить від можливос­ тей Його культивування в умовах лабораторії.

Серед методів молекулярної екології переважають такі:

•сіквенс-аналіз: екстракція з ґрунту нуклеїнових кислот (ДНК, РНК) з наступною ампліфікацією фрагментів гену 16$ рРНК за допомо­ гою полімеразної ланцюгової реакції і вивчення ампліфікованих фраг­ ментів молекулярно-генетичними методами;

•дослідження екстрактів ДНК із різних середовищ за допомогою методу реасоціації та диференційного центрифугування в градієнті СєСІ;

•дослідження екстрагованих із середовищ нуклеїнових кислот методом гібридизації з олігонуклеотидними маркерами (ДНК і РНКзондами, міченими флуоресцентними барвниками);

•метагеномний метод, при якому тоную ться і аналізуються ве­ ликі фрагменти ДНК і метод експресійного клонування. Ці методи дають можливість виявляти не тільки гени Іб в рРНК, але й структурні гени,

відповідальні за роботу окремих ферментів.

Схема використання молекулярно-біологічних методів для аналізу мікробних угруповань представлена на рис. 5.3.

67

Рис. 5.3. Схема використання молекулярно-біологічних методів для аналізу мікробних угруповань баз виділення чистих культур (за Т.П. Туровою, 2004р.)

Найбільш важливими етапами сіквенс-аналізу є наступні:

1. Виділення сумарного препарату нуклеїнових кислот {РНК+ ДНК). Необхідно ретельно відділити фракцію клітин від органічних і не­ органічних компонентів середовища, що особливо важко зробити для такого середовища, як ґрунт. Крім того, слід визначити параметри отри­ мання безклітинного екстракту, оскільки клітинні стінки різних мікроор­ ганізмів потребують різних методів руйнування.

2. Отримання сумарної фракції генів 168 гіЗДА або 168 гОИД, в якій будуть репрезентативно представлені гени 168 гШ А або 168 гОІМА

68

кожного з членів угруповання. Використовують рестрикцію ДНК екдонуклеазами. Можна отримувати ПЛР-амплІфікати генів 16S rRNA без рес­ трикції ДНК. Для цього використовують специфічні пари праймерів (прямого і зворотнього), що є комплементарними консеративним ділян­ кам на 5- і З-кінцях гену.

3.Розподіл фракції iDNA на окремі гени. Для оцінки різноманіття філотипів необхідно розділити фракцію генів 16S rRNA на молекули, які ідентичні за довжиною, але різняться первинною структурою. Для цього використовують спосіб розділу ҐІЛР-ампліфікатів за допомогою молеку­ лярного клонування у клітинах Е.соІі. Застосовують також градієнтні гель-електрофорези (температурний або денатуруючий), внаслідок чого отримують електрофоретичний профіль, у якому кожна смужка у поліакриламідному гелі відповідає якомусь члену угруповання.

4.Аналіз генів 16S rRNA. Точність виконання цього етапу залежить від точного групування ідентичних клонів, що зумовлене набором взятих

удослід рестриктаз окремих клонів. Використовують метод отриман­ ня рекомбінантних DNA. Для цього проводять рестрикцію DNA ендонуклеазами. Фрагменти DNA, що утворилися, встроюють у плазмідний або фаговий вектор і кпонують у клітини Есоїі. У наступному скринікгу отри­ маної бібліотеки вибирають ті клони, які містять вставки генів 16S rRNA. Після визначення послідовностей 16S rRNA їх порівнюють із послідов­

ностями, що є у банку даних. Це дає можливість визначення філогентичного положення членів угруповання. Для розпізнавання рідких і нових видів мікроорганізмів із ЛЛР виключають найбільш поширені послідов­ ності шляхом їх зв’язування зі специфічними пептидами.

Як приклад, на рис. 5.4 наведені результати філогенетичного аналі­ зу мікробного угруповання ґрунту. Було проведено 99 сіквенсів, внаслі­ док чого отримано риботипи (філотипи), що відповідали таким класам:

Bacteroides, Sphingabacteria, Proteobacteria. Firmicutes, Baciltus,

Acidobacteria, Nrtrospirae. Ane більшість типів залишились некласифікованими.

В молекулярній екології застосовують також гібридизаційний аналіз Із використанням генних зондів. Створені генні зонди двох типів: філо­ генетичні і функціональні. Філогенетичні молекулярні зонди можуть бути використані 1) для препаратів ДНК і РНК, що виділені зі зразків пе­ вних екологічних середовищ або 2) для фіксованих цілих клітин. Вико­ ристовують зонди, які здатні гібридизуватися з різкими ділянками послі­ довностей рибосомних генів малої 16S rRNA І великої 23S rRNA. Ство­ рені зонди, що є специфічними на різних таксономічних рівнях - від окремого виду (видові зонди) до усього мікросвіту (пан-зонди).

69

Гг іЧпЕігїгті· : Дірка иМ К Ь ім

П гп іп м , в к М

М ІЩ ^Іг»; МйгОірІгі

ЦкІшКМ

—МІ* -МТІ

_1 І·..МІРм»

» м

Рис. 5.4. Результати філогенетичного аналізу мікробного угруповання фунту

70