Почвенная микробиология / Іутинська Г.О. Ґрунтова мікробіологія

Що стосується дворічних і багаторічних рослин, то найбільш ефек­ тивною є бактеризація у перший рік Тх росту. У наступні роки вирощу­ вання, наприклад, багаторічних трав, дія інтродукованих бактеріальних культур знижується, а на третій рік вона є несуттєвою. Таке зниження чисельності Інтродукованого штаму є закономірним, адже у природних угрупованнях чисельність азотфіксаторів у ризосфері рослин не перебі­ льшує 1-6% . До того ж селекціоновані у лабораторних умовах штами не витримують конкуренції з аборигенним мікробним угрупованням.

Ефективність д ії мікробних препаратів бактеріальних добрив знач­ ною мірою залежить від взаємодії рослин і мікроорганізмів та здатності останніх приживатись, розмножуватись і активно функціонувати на ко­ ренях і в ризосфері рослин. Були проведені досліди, в яких насіння рос­ лин обробляли бактеріями, що мали генетичний маркер - стійкість до стрептоміцину (бЪ-*). Виявилося, що кількість Зїг* популяцій зростає впродовж вегетації рослин і набуває максимальних значень через 3-4 місяці після висіву їнокульованго насіння у ґрунт. Таку закономірність спостерігали щодо культур АгозрігіІІит, АдгоЬасівгіит, АгоЬ>ЬасІег.

10.2. Мікробні препарати для боротьби зі збудниками хвороб і шкідниками рослин

Поряд Із мікробними культурами, які покращують азотне і фосфор­ не живлення рослин, усе ширше застосовують препарати для захисту рослин від хвороб на основі бактерій-антагоністів фітопагенів (табли­ ця 10.4). При розробці таких препаратів спід враховувати, що вони по­ винні мати вибіркову дію: пригнічувати патогенів і не шкодити розвитку ризосферної мікробіоти. Антагоністичний вплив на патогенів може здій­ снюватись декількома шляхами: продукуванням речовин антибіотичної природи або літичних ферментів, які руйнують клітинну стінку, конкуре­ нцією за джерела живлення, різницею у швидкостях росту і конкуренці­ єю за певні екологічні ніші. Так, КІеЬвШа рІапИсоІа, що є основою пре­ парату біоплант, продукує антибіотики антраміцинового раду, які діють проти фітолатогенних грибів, а СЛаеіо/лшт сосМоЮва (основа препа­ рату хетомік) завдяки високій швидкості росту перемагає у конкуренції за субстрат І таким чином пригнічує ріст фітолагенних грибів.

Як було зазначено вище, серед азотофіксуючих та фосфатмобілізуючих мікроорганізмів, на основі яких створені бактеріальні добрива, багато штамів є антагоністами фітолатогенних мікроорганізмів. Розроб­ лені також препарати спеціального призначення, такі як фітослорин, біоплант, ризоппан, полімікюобакгерин.

199

На основі ендофітної бактерії Bacillus subtilis створені високоефек­ тивні препарати фітоспорин, субтилін. Вони застосовуються для оброб-

200

ки насіння сільськогосподарських культур замість їх протравлювання хімічними пестицидами. Клітини і спори бактерій, які е основою препа­ рату, швидко проникають в тканини проростків і захищають рослини в(д патогенів, контамінуючих внутрішні органи. Препарат мас фунгіцидні і бактерицидні властивості. Застосування фітоспорику сприяє підвищен­ ню врожайності сільськогосподарських культур на 20%.

Новим препаратом, запропонованим українськими фахівцями для боротьби з мікоінфекціями, зокрема кореневими патогенами, є хегомік, створений на основі іриба-актагоніста Chaetomium cochlioides. Встано­ влено, що антагоністична дія цього гриба реалізується завдяки тому, що у природних умовах він має більшу швидкість росту і перемагає фітопатогенні гриби у конкуренції за поживні субстрати і життєвий простір. Препарат застосовують під зернові культури, картоплю. В господарст­ вах закритого ф унту вноситься разом з органічною речовиною (гній, со­ лома).

Виділені енгомопатогеннІ мікроорганізми високоефективні проти тих чи інших груп комах, включаючи особливо небезпечні види шкідни­ ків. На основі Bacillus thuringiensis були створені численні біопрепарати. Це бітоксибацилін, ентобактерин, дендробіцилік, гомелін, лепідоцид, турингін та Б)П (Росія); дипел, параспорин, боград, біотрол та турицид (США); біоспор 2802 (Німеччина); бактоспеїн (Франція); бактукал (Юго­ славія); бактуцид та екзобак (Італія); туринжик (Румунія); бацилан (Польща). ЦІ препарати ефективні проти колорадського жука, капустяної совки, білянок, американського білого метелика, вони є надійною замі­ ною хімічних інсектицидів.

Сільське господарство відчуває гостру потребу у високоефективних антипаразитарних препаратах. В Україні був виділений штам Streptomyces avermWIis - вітчизняний продуцент авермектикового ком­ плексу, що має Інсектицидну, акарицидну та кематоцидну дією. Авермектини виявляють здатність блокувати нервовий синапс у комах і нема­ тод, внаслідок чого вони втрачають можливість рухатись і згодом ги­ нуть. Поряд Із нейротоксичною дією авермекгини пригнічують також синтез хітину. Препарат нетоксичний для теплокровних тварин, корисних комах. Швидко розкладається у ґрунті і не накопичує токсичних проміжних про­ дуктів. На основі авермектинів фірма Merk (США) випускає ряд препа­ ратів - абамекгин, івермекгин. В Росії НПО "Фармбіомед’1 випускає фітоверм та аверсект-2 .

Для боротьби з гризунами ефективним є препарат бактероденцид, створений на основі бактерій ісаченко, який не поступається хімічним

201

зооцидам і дозволяє регулювати кількість шкідливих гризунів. Багаторічна практика використання бактеріального методу проти мишо­ подібних гризунів показала його високу ефективність при екологічній і санітарній безпеці.

10.3. Основи технології виробництва мікробних препаратів для рослинництва

Мікробні культури, які є основою препаратів для рослинництва, по­ винні відповідати таким вимогам:

•відсутність патогенних І токсичних властивостей щодо людини, теплокровних тварин, корисних комах, риб, ґрунтових мікроорганізмів;

•максимальний прояв корисних властивостей: азотфіксація, фосфатмобіпізація, антагонізм до патогенів та ік.;

•технологічні властивості у виробництві.

Технологічність культури - це висока швидкість росту в умовах ви­ робничого культивування, невимогливість до складу поживного середо­ вища (тобто здатність рости на дешевих середовищах), стійкість до лізогенних фагів. Якість препарату характеризується т и тр о м живих клі­ тин, тобто Тх кількістю в одиниці об’єму. Виготовлені на основі мікробних культур препарати повинні мати високий титр життєздатних клітин і збе­ рігати його тривалий час. Титр клітин для препаратів на основі швидко­ рослих бульбочкових бактерій повинен бути у межах 18-25, для ловіпьнорослих бульбочкових бактерій - 8-10, для азотобактеру - 2-4, для агробактерій - 20-30 млрд клітин у 1 мл рідкого середовища.

Крім того, важливе значення має зручність транспортування і вико­ ристання препарату. Існують різні форми мікробних препаратів: рідка, гельна, суха, гранульована, (мобілізована на носіях.

Рідка форма - це культура мікроорганізмів, які виросли на рідкому поживному середовищі. Це найбільш проста у виробництві форма, яка містить живу культуру мікроорганізмів. Проте, вона має короткий термін зберігання, потребує спеціально? тари для перевезення.

Суха форма передбачає висушування культури після культивуван­ ня. Найкраще мікроорганізми зберігаються за умов ліофільного висушу­ вання із замороженого стану. Така форма гарантує довготривале збері­ гання, але вона потребує енергоємного устаткування, що підвищує ціну кінцевого продукту.

Г^анульована форма є гетерофазною, препарат, крім культури мік­ роорганізмів, має наповнювачі - глинисті мінерали. Електростатична

202

взаємодія мікроорганізмів із глинистими мінералами підвищує фізіологі­ чну активність бактерій і їх стійкість до несприятливих факторів навко­ лишнього середовища.

Гальна форма є гетерофазною, містить мікроорганізми, гелі - міне­ ральний (сілікагель) і полісахаридний (меляса і мікробний полісахарид),

атакож незначну кількість (близько 1%) пипоподібного лігніну.

Увиробництві мікробних препаратів часто використовують (мобілі­ зацію клітин на носіях - торфі, лігніні, перліті, вермикуліті. В (мобілізова­ ному стані мікроорганізми і біологічно активні продукти їх життєдіяльно­

сті довгий час зберігають активність, не потребують спеціальної тари, легко транспортуються. Перед інокуляцією мікробними культурами носі! проходять попередаю підготовку, яка полягає у подрібненні субстрату, доведенні його рН до нейтральних значень, стерилізації шляхом термі­ чної обробки або дією у-випромінювання.

Технологічний регламент виробництва мікробних препаратів має специфічні операції залежно від того, який мікроорганізм є його осно­ вою. У загальному вигляді він складається з таких стадій: 1 - активація культури після тривалого зберігання шляхом пересівів на поживні сере­ довища; 2 - вирощування культури на рідному поживному середовищі для інокуляції ферментерів; 3 - стерилізація ферментерів І поживного

середовища; 4 —інокуляція стерильного поживного середовища і виро­ щування культури; 5 - приготування з культури, вирощеної на рідкому поживному середовищі певної препаративної форми (рідкої, сухої, гра­ нульованої та ін.).

10.4. Мікробні препарати на основі генетично модифікованих мікроорганізмів

У виробництві мікробних препаратів застосування біотехнологічних методів та генетично модифікованих мікроорганізмів (ГММ) розвива­ ються у таких напрямках: вивчення генетичних основ підвищення ефек­ тивності бульбочкових і віпьноіскуючих азотфіксуючих мікроорганізмів; спільна селекція рослин-живитепів і ризобій для створення ефективних симбіотичних систем, розробка нових високоефективних і екологічно безпечних мікробних препаратів для захисту рослин і тварин від шкідни­ ків і хвороб.

Роботи з біоінженерії базуються на тому, що для отримання гене­ тично модифікованих організмів (ГМО) у ДНК реципієнтндї клітини вбу­ довується донорний генетичний матеріал, що несе певні корисні для людини властивості. Таким шляхом конструюють штам із новими влас-

203

тивостями - трансформант. Наприклад, у нехромосомну ДНК Pseudomonas fiuorescens, яка синтезує фітосгимулюючі речовини, був вве­ дений ген Serratia marcescens, що кодує синтез хітинази. Отриманий трансформант стимулював ріст рослин і пригнічував розвиток фітопагенних грибів завдяки здатності продукувати хігиназу.

Велика увага дослідників приділяється генетичним роботам із діазотрофними мікроорганізмами для підвищення їхньої азотфіксуючої ак­ тивності та покращання симбіотичних властивостей. При застосуванні фізичного, хімічного і транспозонного мутагенезу була отримана значна кількість мутантів із зміненими фізіологічними властивостями, серед яких були і такі, що характеризувалися підвищеною здатністю до азот­ фіксації. Подальші роботи проводили з метою передачі цих цінних влас­ тивостей іншим штамам, при цьому були застосовані методи генетич­ ноїтрансформації, трансдукції, кон’югації·

Гэнетична трансформація - процес, у якому очищеними препара­ тами ДНК передаться інформація від донора реципієнту. Кількість ДНК, яка передається за один акт трансформації, не перевищує 5% геному доноре. Цим методом вдається здійснити перенесення генетичної інфор­ мації симбіотичних ознак.

Трансдукція - перенесення генетичної інформації бактеріофагами. Фаг може переносити довільну ділянку геному (загальна трансдукція) або чітко визначену ділянку (спеціалізована трансдукція). Розмір пере­ несеного фрагменту ДНК не може перевищувати ємність головки бакте­ ріофагу, за допомогою якого здійснюється трансдукція.

Кон'югація - перенесення генетичної інформації у прямому контакті між клітинами за допомогою плазмід, факторів фертильності. F-фактор може стимулювати перенесення некон’югативних плазмід або хромо­ сом. Під керівництвом Р. Діксона була створена рекомбінантна ппазміда pRDl, яка несе гени азотфіксації - nif-гени. Цю ппазміду вдалося пере­ нести до грамнегативких бактерій, які належать до 14 вадів, у тому чис­ лі до бульбочкових бактерій. Серед останніх у восьми штамів спостері­ гали прояви привнесеної генетичної інформації, тобто експресію nif- генів. Ознаки здатності до фіксування атмосферного азоту були вияв­ лені у транскон'югатів, які ке належать до діазотрофів і не виявляли ра­ ніше здатності зв'язувати атмосферний азот.

В Україні М. Нічик зі співавт. провели роботи, в яких плазміда pRDl була перенесена до бульбочкових бактерій конюшини (Rhizobium trifoiii) і люцерни {R.meliloti). Були отримані різні за ефективністю симбіозу транскоя’югати: такі, що не впливали на рослини, такі, що негативно впливали на ріст рослин і симбіоз, і такі, що перевищували вихідний

204

штам за позитивним впливом на рослини і за ефективністю зв’язування атмосферного азоту. Штами з позитивним впливом на рослини були відібрані для подальших дослідів. Набуті лІЇ-ознаки штами зберігали протягом декількох пасажів як на поживних середовищах, так і на рос­ линах. Крім того, деякі транскон’югати виявились менш чутливими до несприятливих екологічних факторів - температури, вологи.

Хоча селекція високоефективних штамів азотфіксуючих бактерій залишається головною ланкою в роботі з підвищення продуктивності біологічної азотфіксації, але вона не може бути відірвана від селекції бобових і злакових рослин, спрямованої на виведення сортів з високою здатністю до забезпечення біологічним азотом. Ця якість, на жаль, була втрачена рядом сортів, оскільки ЇХ селекцію проводили за умов забез­ печення рослин азотом і без урахування здатності сорту забезпечувати інтенсивний розвиток азотофіксуючих мікроорганізмів у зоні коренів.

Для подальшого поліпшення ефективності бобово-ризобіальних і асоціативних взаємовідношень сучасні біотехнології повинні базуватися на селекції як азотфіксуючих мікроорганізмів, так І бобових та злакових рослин із підвищеною чутливістю до застосування біопрепаратів. Останніми роками в багатьох країнах створюються програми селекції бобових і злакових рослин, у яких враховуються ознаки симбіозу і асоціативності. Роботи В.П. Патики, проведені в цьому напрямку в Україні, показали, що ефективність симбіотичної азотфіксуючої системи залежить від багатьох факторів, одним із визначальних є генотип бобової рослини. Селекціоновані сорти сої (Одеська-124, Аркадія Одеська, Кріпиш) та сортономери люцерни з підвищеною азотфіксую­ чою активністю І продуктивністю.

10.5. Проблема біобезпеки

Біотехнололчні. особливо біоінженерні методи торкаються основ­ них властивостей живих організмів - спадковості, мінливості, адаптації, стійкості, продуктивності, якості. Штучне втручання у генетичні структу­ ри, їх модифікація з метою удосконалення біологічних об’єктів можуть викликати такі зміни, наслідки яких не завжди можуть бути передбачені. Це викликає занепокоєння не тільки вчених, а й широкого загалу. Тому актуальним стає питання про біобезпеку.

Біобезпека - це захищеність людини і загалом цивілізації, а також оточуючого середовища від шкідливого впливу, небезпечного для життя і здоров'я людей токсичних і алергенних речовин і сполук, які містяться

205

у природних та модифікованих методами генної інженерії біологічних об'єктах та отриманих із них продуктах.

Генетична модифікація мікроорганізмів пов’язана з певними труд­ нощами адресної доставки гена або групи генів, а також їх нормальної експресії та функціонування реципієнтного організму в цілому. Важли­ вою є також проблема генетичного ризику - можливого отримання му­ тантів, що синтезують токсичні або алергенні сполуки. Дестабілізація механізмів спадковості у ҐМО може відбуватися внаслідок розширення геному за рахунок нових генів або мутагенного ефекту цієї вставки. Крім того, зростає імовірність індукції ендогенних систем рекомбінації або активації генів, які до цього мовчали".

Ризик виникнення таких мутантів зростає за умов використання штучних синтетичних генів для отримання трансгекких мікроорганізмів із покращеними або принципово новими властивостями; можливе також спонтанне перенесення генів-модифікаторів (наприклад, із пилком) до інших рослин, їх взаємодія з генами третіх генотипів, що може призве­ сти до появи нових генотипів із небезпечними властивостями. Такі організми можуть потрапити у фунт і викликати небажані генетичні й екологічні події'.

Питання про біобезпеку порушили у 1974 р. самі засновники біоінженерії. Це були провідні молекулярні біологи на чопі з П. Бергом, який вперше у світі створив рекомбінантну молекулу ДНК. Науковці звернулися до світової спільноти з попередженням про необхідність до­ тримання заходів контролю і біобезпеки при роботі з рекомбінантними організмами. В результаті дискусії, що розгорнулась із цього питання, вчені дійшли висновку, що в генноінженерних експериментах повинен зДійсюватися суворий контроль за виконанняням заходів біобезпеки. У всіх країнах світу розроблені різні методи контролю за технологічними процесами та якістю запропонованих для використання людиною нових біологічних об'єктів і речовин - визначається їхня токсичність, алергенність і загальна безпека для людини і навколишнього середовища.

Існує ймовірність передачі “чужих" генів із ГМО і ҐММ до абориген­ них мікробних популяцій. Були проведені дослідження, в яких у сте­ рильний ґрунт вносили ГММ і реципієнтку культуру. Частота переносу становила З-ІО^-З-Ю *5 кон'югантів на одного донора. При додаванні у ґрунт глюкози вона зростала до 2 -1 0-4 кон'югантів. Тобто у таких місцях існування, як ризосфера, можливий ефективний перенос генів, що було підтверджено з культурами АдтЬасіегіит, Рвеисіо/лолаз, ИМгоМит. Відмічено, що у фунтах, забруднених важкими металами, відбувається селекція, яка сприяє кон'югативному переносу ппазмід стійкості до важ­ ких металів.

206

Перенос хромосомних генів між природними, а також природними популяціями і ҐММ може відбуватися за рахунок трансформації екзо­ генними ДНК або трансдукції фагами. Відомо, що після загибелі мікро­ бної клітини та її руйнування у ґрунт потрапляє мікробна ДНК. У ґрунті ДНК, що вивільняється Із ГММ, знаходиться в адсорбованому на ґрун­ тових часточках стані і набуває стійкості до нукпеаз. ДНК із ГММ може набувати здатності до трансформації геному мікроорганізмів природних популяцій тільки у разі її гомології з ДНК рецілієнтної клітини. Трансфор­ мації ДНК із ГММ у природних популяціях перешкоджає також наявність власних систем рестрикції.

Трансдукція у природних мікробних угрупованнях здійснюється бакте­ ріофагами, що містять 2-нитчаткову ДНК і здаті при лізісі клітин включати до свого складу фрагменти клітинної ДНК. Після зараження нових клітин включені фрагменти ДНК можуть бути інтегровані у геном клітини, але тільки за умов їх гомологи. Тобто можливість трансдукції чужих генів ГММ може бути реалізована, в основному, для близькоспоріднених видів.

При інтродукції у ґрунт ГММ, в першу чергу, повинна бути визначена їх екологічна безпечність. Для цього необхідно враховувати і визначати подальшу долю Іктродукованих ГММ у постійних довготривалих спосте­ реженнях, тобто проводити їх моніторинг.

Якщо модифікований мікроорганізм культивується в лабораторних умовах, його висівають на поживне середовище, а потім ідентифікують наявність введених генів або їх маркерів. За генетичні маркери слугують гени стійкості до рифампіцину, налідиксової кислоти, наявність хромо­ генної або хемолюмінесцентної реакції. Ідентифікація тонованого гену здійснється методом гібридизації генетичного матеріалу досліджуваних клітин із ДНК-зондами, специфічними до тонованого гену.

Для клітин, які не культивуються на лабораторних середовищах, ведіпяють ДНК Із ґрунту Й аналізують її методами ПЛР або Імунологічної детекції з використанням моноклональних антитіл, флюоресцентно мі­ чених антитіл. Якщо у пробі виявлена ДНК із ГММ, то це свідчить про присутність популяцій, які несуть у собі модифіковані гени, а присутність специфічних мРНК вказує на фізіологічно активний стан ГММ.

Можливість забезпечення біобезпеки в генній інженерії базується на таких принципах:

• у біоінженерії використовуються, в основному, природні гени та їх регуляторні генетичні структури, які протягом усієї еволюції підляга­ ють відбору, внаслідок чого вони забезпечують стійкий характер репа­ рації біосинтезу білків та їх якості;

• у всіх біоінженерних лабораторіях розроблений і постійно про­ водиться моніторинг за якістю отриманих ГМО, якістю білкових та Інших

207

їх компонентів, що дозволяє виявляти небезпечні генотипи і не допуска­ ти їх виходу з лабораторії.

У країнах, де інтенсивно ведуться генноінженерні роботи, прийняті закони, які створюють нормативно-правову базу для сучасної біоінже­ нерії, в якій чітко регламентовані основні положення системи біобезпеки. Проте, у країнах ЄЕС на нинішній час ставлення до ГМО є неодно­ значним. Европарламект прийняв низку спеціальних документів, які об­ межують, а в деаких випадках забороняють вихід у навколишнє середо­ вище генетично модифікованих рослин та інших організмів, У той же час у США, Великобританії, Франції прийняти урядові рішення на під­ тримку біоінженерії, що дозволяють використання ГМ-роспин. У вирі­ шенні проблеми біобезпеки повинні брати участь не тільки генетики, а також екологи, лікарі, алергологи, фармацевти.

208