Konspekty_Enzimologiya

●непрерывная регистрация

○Спектрофотометрия.

■При некоторых реакциях продукт и субстрат отличаются только высотой пика поглощения. Это возможно измерить. Удобный метод, но часто пики накладываются. Уходим от максимума поглощения, чтобы минимизировать действие второго вещества - потеряем чувствительность метода. У уридиловых нуклеотидов у субстрата и продукта один спектр поглощения (один пик над другим).

■Можно вместо субстрата использовать его аналог с другим спектром поглощения.

■Можно проводить сопряжённую реакцию, превращая продукт в какое-то ещё вещество и меряя его поглощение. НО мы должны быть уверены, что промежуточное вещество не накапливается; II фермент должен иметь достаточно высокую активность, быть доступным, начинать работать при низкой концентрации исходного (в своей реакции) вещества; I и II ферменты должны хорошо работать при одном рН (ну или можно взять очень много II фермента)

■Можно использовать окрашенные искусственные субстраты. Например, п-анилидное производное с “пептидной” связью при расщеплении даёт окрашенный продукт.

○измерение флуоресценции - Эффективнее, но сложнее и дороже.

■метод высокочувствительный (выше на 2 порядка, измеряет даже гаммы в кювете), почти нет фона.

■можно варьировать 2 параметра (спектр поглощения и спектр испускания): если вещества одинаковы по поглощению, но спектры испускания могут быть разные.

■кювета должна быть термостатируемой

■умбилиферон - алкалоид Зонтичных, в свободном виде флуоресцирует хорошо, в связанном - меньше

○электродные методы

■измерение рН (с его изменением меняется активность фермента - осторожно!)

●надо мерять в таких интервалах рН, чтобы изменения активности были несущественны

●надо иметь очень чувствительный рН-метр

●можно вообще не пользоваться буфером, а поддерживать рН путём титрования (можно с помощью перистальтического насоса, который подаёт жидкость дискретными шагами и считает их - автотитратор)

●еще можно взять очень разбавленный буфер, чтобы он перестал “буферить” сразу после начала реакции.

■измерение ион-специфическими электродами. Например, измеряя [NH4+], можно судить о дезаминировании. Са,Na,K - о работе транспортной АТФазы.

■измерения платиновым электродом. Например, им можно мерить [О2]. В биоэнергетике часто пользуются платиновым электродом (то есть просто измерение ОВР-потенциала). Но при большом потенциале вещества окисляются.

■Полярография - редко используется, на ОВР.

○манометрические методыиспользуются в процессах, в которых выделяются газы, например, в связанных с клеточным дыханием. Проблемы:

■герметичности

■если в процессе реакции выделяется или поглощается не 1 газ (например, в дыхании участвуют кислород и углекислый газ)

■необходимость постоянного перемешивания (сложно засунуть мешалку, надо трясти)

■растворение газа в жидкости

Манометрическими методами можно измерять активность декарбоксилаз, дезаминаз.

●дискретная регистрацияметод отбора проб: замеряются порции реакционной массы, отбираемые через промежутки времени.

○как моментально остановить реакцию в пробе? - добавить кислоту или щёлочь, сильно охладить раствор

○фермент вводится холодный (в процессе реакции изменяется температура, т.к. стеклянная пипетка, которой вносится фермент, другой температуры; поэтому введение должно быть быстрым).

○как определять вещество? - можно цветными реакциями или использовать сопряжённые системы

○сложно зарегистрировать нулевую точку (должен быть фермент, но он не должен как бы работать, за 30 секунд уже реакция пойдет) Нужно сделать контроль - смесь с ферментом, но при этом чтобы реакция не шла (сразу добавить кислоту). Помогает выявить побочные процессы и “обнулить”.

Про количество точек - чем больше, тем лучше, но каждую точку надо обрабатывать! Мало точек - это плохо, ПОЭТОМУ ОПТИМАЛЬНОЕ КОЛИЧЕСТВО - около 4 + нулевая (контрольная) . Частота отбора 3-5 минут.

29.9.15 Использование ферментов. Критерии реагента. Проблемы выделения ферментов.

Ферменты можно использовать для:

1)Получения чего-то нужного

2)Очищения пробы от чего-то ненужного (например, если удалить белки, повышается растворимость ДНК; или в стиральный порошок добавляют липазы и протеазы)

3)Размножения молекул (как пример - Qβ-полимераза из Qβ-вируса: она может растить на чашке Петри РНК-колонии)

4)Как аналитические реагенты (например, для определения крахмала с помощью амилазы; так определяют глюкозу в крови - с помощью глюкозооксидазы).

5) Собственно, исследования самого фермента

Важнейшие критерии фермента:

●очистка (используемый фермент должен быть чист от примесных ферментных активностей)

●доступность

●стоимость производства

=> встаёт проблема выбора объекта для выделения фермента

BTW, инсулин горбуши не отличается от человеческого по последовательности. Но это сезонный материал.

Важны условия выращивания объекта, например, добавлять вещества, индуцирующие экспрессию фермента (добавлять лактозу или IPTG для индуцируемого промотора

β галактозидазы, под которым стоит наш трансген в бактерии).

Для получения фермента из микрообъектов важно добавлять правильный субстрат, иначе фермент может и не вырабатываться, и следить за фазой роста культуры (лучше всего выделять в стабильную фазу). Но если уж нужна экспоненциальная фаза роста, то лучше брать от ⅓ до ½ этой кривой.

Иногда клеткам нужны экзотические условия: например, в сухих дрожжах больше гликозидаз, чем в свежей культуре.

Для получения фермента из макрообъектов необходимо выбрать не только орган (ткань), из которого будет производиться выделение (в разных частях разные количества можно выделить), но и физиологическое состояние организма.

Как достать фермент? - экстрагированием. Иногда опасно: в поджелудочной железе часто бывают протеазы => Нужно осторожно выделять ферменты из поджелудочной, ибо они могут быть порезаны протеазами. Или каким-то образом заингибировать протеазы.

Проблема также если многосубъединичные ферменты. Но она решаема, например, в Институте молекулярной генетики получают субъединицы, потом их собирают.

С генной инженерией просто разобраться у ферментов, представленных одной полипептидной цепью. Их можно экспрессировать где угодно.

Особенности получения ферментов в бактериях с помощью генной инженерии:

●Если хотим из бактерий получать, то нужно встраивать именно кДНК (она без интронов), потому что бактерии не могут вырезать интроны из эукариотической ДНК.

●Если наши бактерии синтезируют много необходимого нам белка, то нужно озаботиться подкормкой аминокислотами или включить иные пути синтеза аминокислот, поскольку в нашем белке другие частоты встречаемости разных аминокислот, чем в белках бактерий.

●Необходимо учитывать кодоновый контекст, поскольку эу- и прокариотические организмы могут использовать разные кодоны для синтеза одной и той же аминокислоты. Поэтому кДНК иногда приходится синтезировать химически.

●Белки, искусственно синтезированные в большом количестве, в отсутствие шаперонов могут начать неправильно сворачиваться. тогда в клетках образуются белковые включения - кристаллики\тельца включения => Их нужно частично растворить в денатурирующих условиях (в 6M мочевине), а потом ренатурировать - не факт, что белок после такого выживет. Такая проблема с получением инсулина из Е. coli - он там накапливается в виде неприятных гранул.

●Часто на концах появляются лишние аминокислоты (Патрушев синтезировал продуцента Taq-полимеразы с двумя лишними аминокислотами - как маркер, чтоб никто не подделал).

●У бактерий нет такой системы посттрансляционной модификации, как у эукариот (самая большая проблема - с гликозилированием). Гликозилирование специфично для эукариот и часто уникально для организма. В таком случае трансгены можно экспрессировать в дрожжах или в более близких к видуисточнику трансгена организмов.

Экстракция ферментов из разных частей организма:

Секретируемые ферменты - достаточно легко получить фермент в растворе, микроорганизмы или грибы сами выделяют во внешнюю среду.

Пищеварительные ферменты - легко выделить фермент - типа то же самое, что и секретируемые. Собака Павлова. Наращивание белка обеспечивается усилением секреции (сопряженного с посттрансляционными модификациями).

Внутриклеточные ферменты:

○если на поверхности мембран ничего толком нет (животные клетки), то их легко разрушить в высокоскоростном блендере типа кухонного комбайна. Механическая рубка с помощью

гомогенизатора Поттера (на рисунке). Работает по принципу проточной мясорубки с тефлоновым пестиком внутри. Гидродинамический сдвиг в зазоре => разрушаются клетки, остается субклеточные структуры.

Проблема - материал сильно нагревается (в мешок со льдом опускаем гомогенизатор). Есть еще разрушение осмотическим шоком. Не позволяет работать с большими кол-вами. Если добавим буфер - еще меньшее кол-во выделяемого вещества.

○если на поверхности мембран есть клеточная стенка:

■кости, древесина - вначале мельчат молотком или пилой, потом закидывают в блендер.

■твердые клеточные стенки - тоже измельчение блендером, предварительно охладив и растерев в ступке.

Еще полезные штуки для измельчения твердых объектов: для облегчения растирания можно в смесь ввести абразивный материал (песок, колотое стекло, стеклянные шарики). Клетки можно сломать ультразвуком (жёсткий способ, в определённых участках образца образуются стоячие волны). Но при этом будет

сильное нагревание препарата, что не всегда хорошо, особенно если мы хотим выделить фермент.

Кухонный комбайн - два ножа, верхний термостатировать не можем, нижний можем.

Лучше всего - не подвергать долгому воздействию - три раза по минуте с остыванием.

6.10.15 Методы разрушения клеток, действия после разрушения, очистка и концентрирование фермента

Подход 1 разрушение клетки давлением - довольно мягкий подход:

Пропускают суспензию клеток через тонкие каналы под давлением (можно даже через шприц с тонкой длинной иглой). Соотношение диаметра и скорости позволяют регулировать степень разрушения. Не возникает долгого теплового воздействия (сразу собираем получившуюся массу в ледяную баню). Но клетки могут и не разрушиться. Например, дрожжи. Продавливается замороженная масса (см. далее)

Ещё есть версия с металлической пластинкой с маленьким отверстием. Можно регулировать давление. Одноклеточные организмы разрываются из-за гидродинамической разницы давлений на краях отверстия.

Подход 2:

Можно продавливать замороженную суспензию клеток. В процессе возникает эффект фазового перехода льда - за счет перестройки кристаллов разрушается мембрана. Но сложно создать достаточно точно подогнанный прибор (на рисунке: деталь 2 должна входить в отверстие 3 очень точно, чтобы не оставалось пространства между стенками; 11 - куда собираем получившийся гомогенат, 5 - тонкий капилляр, через который проталкиваем массу, 4 - сюда помещаем суспензию клеток, 2 - пестик). Плюс: тут не происходит нагрева.

Подход 3:

Используется пресс - “универсальный гомогенизатор”. (гомогенизатор Manton-Gaulin) Есть сосуд с суспензией. Насос подает ее в камеру под давлением, камера занята иглой. Игла отходит на крошечное расстояние, туда проходит немного массы, клетки лопаются. Давление падает, игла встает на место, потому что она толкается пружиной. В итоге колебания давления происходят с ультразвуковой частотой, так что все клетки лопаются. Оптимизация жесткости пружины и скорости подачи материала могут позволить разрушать плазмалемму, а ядра не разрушать. В итоге вязкий хроматин в раствор не попадает.

Проблема использования такого гомогенизатора у бактерий: вязкая ДНК у них в цитоплазме.

Подход 4:

Иногда необходимо более мягкое разрушение: клетки обрабатывают лизирующими ферментами (комплексами ферментов, которые встречаются в природе), например из желудка виноградной улитки (Helix) - Helicase™ или у грибов. Еще толуол для цитоплазматических белков бактерий используют.

BTW, источник лизоцима - белки куриных яиц. Haemophilus influenzae - источник 3 типов рестриктаз.

Сейчас часто используют клонирование генов в удобных продуцентах. Мы можем помещать ген в такое окружение, которое обеспечивает максимальную эффективность трансляции белка.

Что делать после разрушения?

Поместить фермент в условия, где он стабилен:

●рН - меняется при разрушении, активизируются ферменты, меняющие рН среды. Например, разрушается растительная вакуоль - закисление. В мышцах ферменты гликолиза.

●окислительно-восстановительный потенциал - для многих важно сохранение SH групп: добавляют меркаптоэтанол, дитиотреитол.

●объём буфера - необходимо много жидкости - в 2 раза больше массы пробы, нужно в том числе для стабилизации рН. Для сочных объектов - 1:1.

●наличие протеаз - их нужно ингибировать:

○понижением температуры,

○путем связывания активного центра.

■У сериновых протеаз серин в активном центре ингибируют фторангидриды некоторых кислот, например, диизопропилфторфосфат. Но он ещё ингибирует сериновый остаток в холинэстеразе (зарин и зоман - его аналоги), поэтому выдуманы другие, менее опасные ингибиторы сериновых протеаз, например, тот, что на рисунке - бензилсульфанилфторид [или -хлорид]:

■Протеазы других классов (их всего 4) ингибируют синтетическими пептидами (но они дорогие)

●растворимость: часто вводят детергенты для повышения растворимости фермента

●ионная сила

Белки: глобулины (растворимы в растворах с низкой ионной силой), альбумины (растворимы при определённой ионной силе, в чистой воде денатурируют)

Рисунки только про альбумин:

На первой картинке растворимость зависит от того, насколько гидрофобный участок, насколько прочно связывается с водой. На второй на пике - наибольшая растворимость.

13.10.15 Методы осаждения белков: растворителями, высаливанием, термоинактивацией. Катионнообменники и анионообменники.

Осаждение:

1)Солями (связывают воду - осаждают некоторые белки, но не все!). Чаще всего используется сульфат аммония - хорошо растворим (до 4М используют), молекулы большие. Должен быть чистым (прежде всего от тяжелых металлов - железо, свинец и пр). Раствор будет закисляться, что может быть нежелательно для ферментов - нужно контролировать рН.

2)Органические растворители - используются растворители, хорошо смешивающиеся с водой. Важно соблюдать температурный режим, нужна быстрота процесса, гидратация идет с выделением тепла (его нужно отводить) тут будет гидратация? тут разве вода будет присоединяться ?Ацетон и этанол неограниченно растворяются разве если они растворяются, это можно назвать гидратацией, я думала, что гидратацияэто присоединение воды.? . Растворитель добавляем по стенке, по чуть-чуть, в стакане на ледяной бане. Нужна посуда из материала, хорошо проводящего тепло. НЕ используем фарфоровый стакан.

Обычно время добавления выбирают в зависимости от интенсивности

выделения тепла. После добавления - инкубация в течение 5 минут, затем - сразу центрифугировать. После того, как слили растворитель, НЕЛЬЗЯ высушивать белок ДОСУХА! Сливаем растворитель, даем остаткам стечь, затем перерастворяем в большом количестве другого растворителя (часто - ацетон). Или высушиваем под вакуумом.

(Эта картинка не очень точная. Во-первых, должен быть более резкий спад, во-вторых, мы берем условно говоря осадок 4-5 аликвоты (а не 3-4), т.к. 3 еще грязная)

Можно сделать ацетоновый порошок - растворить в большой концентрации ацетона, затем высушить на вакууме - такие порошки могут довольно долго храниться.

При осаждении происходит концентрирование белка. Также освобождаемся от НМС примесей. Но остается соль/растворитель (избавляемся с помощью диализа или гельфильтрации). При осаждении солями в растворе остаются полисахариды и НК.

ДНК (с белками) можно осадить полиэтиленимином (многотоннажный реагент. Добавляется в экстракт после ЦФ-ния. рН 8.0)

Риванол осаждает амилазу специфическим образом. (метод Акабори)

В отличие от высаливания, лучше брать осадок на определение активности.

3) Температурное осаждение (термоинактивация) - используем температуру, подходящую для нашего белка, но денатурирующую остальные белки. Важно быстро нагреть и быстро остудить спустя необходимое время + нужно подобрать подходящие условия - температуру инактивации белка. Используют схему конька-горбунка: сосуд с экстрактом по очереди опускают в 1 - горячую воду, 2 - термостат с

определенно подобранной средней температурой, 3 - ледяную баню. Везде подбираем температуры, подходящие для нашего белка. Важно строго точно поддерживать температуру. Фермент-субстратный комплекс термостабильней свободного фермента. (Вирусы, активирующие ДНК-лигазу выделяли так: до 43 градусов, термостат, потом на крышу.)

Другие методы очистки белка:

1)хроматография

-гель Al(OH)3 или гидроксилапатит (CaOH)3PO4 (позволяет разделить двухнитевые и однонитевые ДНК) - древний метод. Гидроксилы хорошо замещаются на другие ионы, в том числе заряженные группы белка. Разные белки сорбируются с разной прочностью. Первоначально это делали как осаждение - очистка в 508 раз. Промываем фосфатным буфером. Сейчас перешли на колоночную хроматографию. Осаждение теперь используют только для больших объемов.

-ионообменная хроматография - качество деления мало зависит от качества колонки. Первые ионообменники - сульфоугли. Матрицы из сульфопроизводных полистирола - работают почти для всего, кроме углеводов и белков (с белками связываются, как правило, необратимо). Для белков используются гидрофильные матрицы - целлюлоза (лучше