8

Лекция 7.

Активный транспорт веществ через мембраны.

Процессы активного транспорта играют большую роль в функционировании жи­вых систем. За счет них в различных отсеках клетки создаются и поддерживаются гради­енты физических и химических величин ( концентраций веществ, электрических потен­циалов ). Благодаря процессам активного и пассивного транспорта обеспечивается под­держание стационарного состояния (гомеостаза) живой системы. Существование актив­ного транспорта веществ через биологические мембраны впервые было показано в экспе­риментах Уссинга в 1949 году на примере переноса ионов натрия через кожу лягушки.

Как было отмечено, активный транспорт веществ не происходит самопроизвольно и требует затраты энергии. В биологических мембранах активный транспорт молекул и ионов сопряжен с гидролизом АТФ, т.е. энергия макроэргической химической связи ис­пользуется для переноса вещества. Согласно современным представлениям, на плазмати­ческих и внутриклеточных мембранах функционируют специальные ионные насосы, пе­рекачивающие ионы за счет свободной энергии гидролиза АТФ. В сущности эти насосы представляют собой комплексы интегральных белков-ферментов ( транспортных АТФ-аз) с молекулами липидов мембран. К настоящему времени известны три типа электрогенных ионных насосов, осуществляющих активный перенос ионов через мембраны: К⁺, Na⁺- за­висимая АТФ-аза плазмалеммы (К⁺, Na⁺- насос), Са²⁺- зависимая АТФ-аза (Са²⁺- насос), Н⁺-зависимая АТФ-аза мембран хлоропластов и митохондрий (Н⁺ -насос, или протонная помпа).

При работе К⁺, Na⁺- зависимой АТФ-азы, при гидролизе одной молекулы АТФ, в клетку переносится 2 иона калия и одновременно из клетки выкачиваются 3 иона натрия. При работе Са²⁺- насоса за счет энергии гидролиза АТФ транспортируются 2 иона кальция, а при работе протонной помпы – 2 иона водорода. Молекулярные механизмы работы ионных насосов пока еще до конца не разгаданы. Тем не менее, основные этапы работы этих сложных систем известны. Наиболее изученным в этом плане является К⁺, Na⁺- на­сос. Рассмотрим подробно структуру и работу этого насоса. Эта система отвечает за под­держание высокой концентрации ионов калия и низкой концентрации ионов натрия внутри клетки по сравнению с окружающей средой. Na⁺, К⁺ - зависимые АТФ-азы обна­ружены в плазматических мембранах различных типов клеток, и их работа имеет огромное фи­зиологическое значение. На работу этих насосов клетка в состоянии покоя затрачивает более 30 % синтезируемой АТФ. В частности, за счет работы этих насосов поддержива­ется электрическая возбудимость клеток, например нервных и мышечных клеток животных, создается движущая сила для транспорта через плазматическую мембрану сахаров, аминокислот и других соединений.

Функционирование К⁺, Na⁺- зависимой АТФ-азы впервые было показано английским исследователем Я. Скоу. Он обнаружил фермент, гидролизующий АТФ только при добавлении в среду К⁺, Na⁺ и Mg^2+. Сейчас известно, что плазматическая Na⁺, К⁺ - зависимая АТФ-аза представляет собой тетрамерный белок α₂ β₂ с м.м. 270 кД. Большая α-субьединица с м.м. 95 кД представлена интегральным бел­ком и содержит участок связывающий молекулу АТФ (Рис. 1.). .

Рис.1. Схематичное изображение Na⁺, К⁺ - зависимого насоса на плазматической мембране (стр. 187,костюк)

Меньшая β- субьединца имеет м.м. 40 кД и располагается на наружней части билипидного слоя. Она содержит углеводные группы Участок связывания АТФ обращена к цитоплазме, и только АТФ, нахо­дящаяся внутри клетки, служит эффективным субстратом для этой АТФ-азы. Сердечные глюкозиды ( стероиды) ингибируют АТФ-азу только в том случае, если они находятся снаружи клетки.

При гидролизе одной молекулы АТФ происходит перенос трех ионов Na⁺ из клетки и двух ионов К⁺ в клетку.

Цикл работы насоса включает следующие основные этапы:

Связывание АТФ (фосфорилирование АТФ-азы) происходит только в присутствии Na⁺ и Mg²⁺:

E + ATФ ^{Na+, Mg2+}  Е -Р + АДФ

Рис. 2. Схема изменений конформации АТФ-азы в процессе транспорта ио­нов(стр.185, Костюк).

Далее в присутствии ионов калия происходит дефосфорилирование фермента:

Е -Р + Н₂О ^К+ Е + Ф

Таким образом, мембранная АТФ-аза характеризуется Na^+- - зависимым фосфорилиро­ванием и К⁺ –зависимым дефосфорилированием. Всего в процессе транспорта ионов калия и натрия и сопряженном с этим гидролизе молекулы АТФ фермент прини­мает, по крайней мере, четыре конформационные формы: Е_1, Е₁ – Р, Е₂ – Р, Е₂ (Рис. 9).

Е_{1 -} свободная форма фермента, обладающая сродством к ионам натрия. Е₁ – Р – первая фосфорилированная форма фермента в комплексе с 3 Na⁺ . В этом состоянии ион связывающий участок обращен внутрь клетки и ионы Na⁺ захватываются из цитоплазмы клетки. Е₂ – Р – вторая фосфорилированная форма фермента, в комплексе 2 ионами К⁺. В этом состоянии ион связывающий участок обращен к наружи клетки и ионы калия захватываются из вне­клеточной среды. Е₂ -свободная форма фермента, обладающая сродством к ионам калия. Таким образом, Na⁺ запускает фосфорилирование, а К⁺ - дефосфорилирование . Фосфо­рилирование стабилизирует форму Е₂ , дефосфорилирование – форму Е_1. Предполага­ется, что эти два формы фермента имеют небольшие конформационные различия.

Как видно из этой схемы, ключевыми этапами работы фермента являются : 1) образо­вание комплекса фермента с АТФ на внутренней стороне мембраны ( это реакция активи­руется ионами магния); 2) связывание фермент-субстратным комплексом трех ионов натрия; 3) фосфорилирование фермента с образованием АДФ; 4) конформационная перестройка (пере­ворот «флип-флоп») фермента в мембране; 5) обмен ионов натрия на ионы калия, происхо­дящая на внешней поверхности мембраны; 6) обратный переворот ферментного комплекса с переносом ионов калия внутрь клетки; 7) возвращение фермента в исходное состояние с ос­вобождением ионов калия и неорганического фосфата.