Лекция 6.

Биофизика клеточных процессов. Мембраны, их состав, структура. Мембранный транспорт.

Биологическими мембранами называют функциональные структуры клеток, ограничивающих цитоплазму и большинство внутриклеточных структур. Мембраны также образуют внутри клетки единую систему канальцев и полостей. Толщина биологических мембран составляет 7-10 нм, однако вследствие большой общей площади мембран и их высокой плотности, их масса составляет более 50 % сухой массы клетки. Биологические мембраны являются высокоизбирательными барьерами про­ницаемости. Поток молекул в клетку и из клетки, в органоид и из нее, контролируется находящимися в мембранах специфическими системами транспорта. Транспортные процессы в мембране регулируют объем клетки и поддерживают ионный состав, необходимый для работы ферментативных систем, т.е. гомеостаз клетки. Транспортные процессы также создают ионные градиенты, необходимые для создания мембранного потенциала, под­держания возбудимости, а также транспорта некоторых молекул и ионов. Системы транс­порта в мембране переносят из внешней среды и концентрируют в компартментах клетки вещества, необ­ходимые для функционирования клетки. Так как клетки и внутриклеточные структуры, с точки зрения термодинамики, открытые системы, они постоянно обмениваются с окружающей средой и веществом и энергией. Поэтому транспорт вещества и энергии через мембраны - необходимое условие существования живых систем.

Состав и структура биомембран.

Состав мембран зависит от их типа и функций, однако во всех типах биологических мембран основными структурными компонентами являются молекулы липидов и белков. Некоторые мембраны содержат также и углеводы, которые связаны или с белками (гликопротеины) или с липидами (гликолипиды). Важным структурным компонентом мембран является вода. Взаимодействие молекул липидов, белков с водой определяет специфические структурно-функциональные свойства мембраны и определяет стабильность мембранных структур.

В состав биологических мембран входят молекулы, относящиеся к различным классам липидов, а также стероиды. Мембранные липиды имеют сравнительно небольшую полярную (заряженную) головку и длинные неполярные (незаряженные) углеводородные цепи. Жирные кислоты, входящие в состав липидов мембран, могут быть насыщенными и ненасыщенными двойными связями и обычно имеют 14-22 углеродных атома.

У фосфолипидов (фосфоглицеридов) неполярная часть представлена двумя остатками жирных кислот, этерефицирующих две гидроксильные группы глицерола. Третья гидроксильная группа образует полярную головку – остаток фосфорной кислоты. К остатку фосфорной кислоты может быть присоединен остаток аминоспирта (например, фосфатидилхолин), сахара (фосфатидилинозитол), аминокислоты (фосфатидилсерин).

Сфинголипиды построены из одного остатка жирной кислоты, из одного остатка длинноцепочечного аминоспирта сфингозина (или его производного). Полярная головка этих молекул представлена остатком спирта.

Из стероидов наиболее распространенным компонентом мембран является холестерин (холестерол) и его производные. Содержание холестерина характерно для мембран эукариотических клеток, у большинства прокариот он не обнаружен.

Белковый состав мембран также исключительно многообразен. Мембраны многих клеток содержат большое число белков, с молекулярной массой 10 до 250 кДа. Молекулы белков могут быть либо частично, либо целиком, погружены в липидный бислой или могут пронизывать его насквозь. Это так называемые интегральные белки. Белки, которые слабо удерживаются на мембране за счет слабых, в основном электростатических, взаимодействий, называются периферическими. Молекулы белков в составе мембран выполняют ферментативные, транспортные, регуляторные и опорно-строительную функции. Относительное содержание белков и липидов в составе мембран зависит от типа клеток и от специфики мембранных функций. Так, в составе внутриклеточных мембран (митохондрий, микросом) содержание белка выше, чем содержание липидов. В мембранах нервных клеток млекопитающих содержание белка составляет всего 20-25 % по сухой массе ( табл.1)

Таблица 1

Относительное содержание белков и липидов в составе различных мембран (% от сухой массы)

Вид мембран	белки	липиды
Миелиновая оболочка нервных клеток млекопитающих	22	78
Плазмалемма эритроцитов человека	49	44
Плазмалемма клеток печени млекопитающих	60	40
Наружная мембрана митохондрий млекопитающих	55	45
Внутренняя мембрана митохондрий млекопитающих	78	22
Микросомы клеток печени млекопитающих	62	32

Относительное содержание представителей того иного класса липидов, белковых молекул, также зависит от структурных осо­бенностей и функциональных свойств мембраны. Так, мембрана нервных клеток, содержит небольшое количество белка ( 18 % массы мембраны). В плазматической мембране большинства клеток содержание белка достигает до 50 % массы, так как различные ионные насосы, каналы, рецепторы, ферменты представлены, в основном, молекулами белков. Наиболее высоким содержанием белков характеризуются мембраны внутренние митохондрий и хлоропластов, где располагаются электронно- транспортные цепи и происходит синтез АТФ. В составе мембран большинства типов клеток наиболее распространены следующие молекулы липидов: фосфатидилхолин (лецитин), фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозитол. Мембраны эукариотических клеток богаты также холестерином.

В таблице 2 приведены данные о липидном составе различных мембран клеток млекопитающих.

Таблица 2

Содержание липидов в составе плазматической мембраны и мембран органоидов животной клетки ( в % к общей массе липидов)

Липиды	Плазмалемма	Митохондрии	Лизосомы	Ядро	ЭПС	Аппа рат Гольджи
Фосфатидил холин	18	38	23	44	48	25
Сфингомиелин	12	0	23	3	5	7
Фосфатидилэтаноламин	11,5	28,5	12,5	16.5	19	9
Фосфатидилсерин	7	0	6	3,5	4	2,5
Фосфатидилинозитол	3	2,5	6	6	7,5	5
Лизофосфатидилхолин	2,5	0	0	0	1,5	3
Дифосфатидилглицерин	0	14	5	1	0	0
Холестерин и ее эфиры	22	3	22	11	6	12
Свободные жирные кислоты	6	-	-	9	4	18
Другие липиды	15	15	2,5	5,5	5	16

Воду, входящую в состав мембран, подразделяют на связанную, захваченную и свободную. Связанная вода - это вода гидратных оболочек ионов и полярных участков липидов и белков. Гидратные оболочки основных структурообразующих липидов состоят из 10-12 молекул воды. Эта вода осмотически и химически неактивна и не способна растворять какие - либо вещества. Захваченная вода находится в основном между двумя слоями в липидов мембраны. По подвижности, химической активности она занимает промежуточное положение между связанной и свободной водой. Свободная вода входит в состав мембраны в виде самостоятельной фазы и обладает всеми свойствами жидкой воды.

Современные представления о структуре мембран

Совокупность экспериментальных данных, полученных при исследовании природных и синтетических мембран электронномикроскопическими, физико-химическими методами, позволили предложить жидкостно-мозаичную модель строения биологических мембран. Впервые эта модель была предложена в 1966 году С.Сингером и Г. Николсоном. В соответствии с этой моделью, структурную основу биологической мембраны образует двойной слой фосфолипидов, инкрустированный белками (рис.1). При физиологических условиях липиды находятся в жидком агрегатном состоянии. Это позволяет сравнить мембрану с фосфолипидным морем, в которое погружены интегральные белки - «айсберги». Полярные головки молекул липидов обладают гидрофильными, а неполярные хвосты – гидрофобными свойствами

В водной среде термодинамически выгодно, чтобы полярные головки липидов погружены в жидкую воду, а неполярные хвосты были бы расположены подальше от воды. Экспериментально показано, что из молекул фосфолипидов в водной среде происходит самосборка бислойной мембраны. Стабилизация такой структуры происходит за счет гидрофобных взаимодействий между неполярными хвостами симметрично расположенных липидов каждого монослоя и электростатических связей между полярными головками липида и молекулами воды. Концы бислойной мембранной структуры в водной среде замыкаются с образованием липидных пузырьков. Такие везикулы обозначают термином «липосомы» (подробно на стр.4).

Рис.1. Жидкостно-мозаичная модель строения элементарной биологической мембраны (Антонов.с.14)

Очень существенным для формирования и стабилизации бислоя является то обстоятельство, что пространственная структура молекулы липида имеет характерную цилиндрическую форму (рис. 3, 1). Как видно из рисунка, липидный цилиндр по длине разделен на две неравные части: гидрофильную «головку» и гидрофобный «хвост». Гидрофобная часть большинства липидов мембран представлена двумя остатками молекул длинноцепочечных жирных кислот. В водном растворе гидрофобные хвосты липидов каждого слоя примыкают друг другу, а полярная часть молекул взаимодействует с молекулами окружающей воды (рис.3.2). Таким образом происходит стабилизация билипидного слоя в водной среде. Между остатками жирных кислот мономолекулярных слоев возникают гидрофобные взаимодействия, между полярными головками липида и молекулами воды образуются водородные связи, электростатические и Ван-ДЕР-Ваальсовы взаимодействия. Присутствие в бислое молекул липидов с одним хостом, имеющих в пространстве конусообразную форму, нарушает структуру мембраны.

голова

1

2

Два хвоста

Рис. 2. Схематичное изображение молекулы фосфолипида (1) и образования липидного бислоя (2). (Антонов с.15). Рисунок доделать

Динамика биологических мембран. Фазовые переходы фосфолипидных молекул.

Функционирование биомембран зависит от микровязкости липидного бислоя, от подвижности липидных молекул, от их фазового состояния. Липидная фаза мембран в физиологических условиях находится в жидком агрегатном состоянии. Молекулы жидкости, как и молекулы твердого вещества, совершают колебательные (и вращательные) движения около положения равновесия. Через определенное время (так называемое "время оседлой жизни") происходит перескок молекулы в другое положение равновесия. Время оседлой жизни τ молекул жидкости значительно меньше, чем молекул твердых веществ. В частности, для молекул фосфолипидов в составе биомемембран τ = 10^-7 - 10^-8 с. Как уже отмечалось выше, молекулы в мембране расположены не беспорядочно, а в определенном порядке: фосфолипидные молекулы находятся в двойном слое, их гидрофобные хвосты приблизительно параллельны друг другу. Есть порядок и в ориентации гидрофильных головок липидов. Такое физическое состояние вещества, при котором агрегатное состояние жидкое, а в расположении молекул наблюдается определенный порядок, называется жидкокристаллическим состоянием. Жидкие кристаллы могут образовывать так называемые «длинные молекулы», поперечные размеры которых значительно меньше продольных. Бислойная липидная мембрана соответствует смектическому жидкокристаллическому состоянию, когда молекулы располагаются параллельно друг другу и располагаются слоями.

Коэффициент вязкости  (динамической вязкости) биологических мембран составляет 30 -100 мПа с. Такой величиной вязкости обладает подсолнечное масло при нормальных условиях. Вязкость воды при этих условиях равняется 1 мПа с. Использованием флуоресцентной, ЭПР, ЯМР – спектроскопии показана высокая подвижность фосфолипидных и белковых молекул в мембране. Подвижность этих молекул обуславливает латеральную (боковую) диффузию - хаотичное перемещение этих молекул в плоскости мембраны. При латеральной диффузии соседние молекулы скачкообразно меняются местами, и вследствие таких перескоков, молекула перемещается по мембране. Перемещение среднестатической молекулы можно оценить по коэффициенту диффузии через среднеквадратичное смещение:

D = Х־² / 2 Δ t

Показано, что среднеквадратичное смещение фосфолипидной молекулы по мембране эритроцита составило 5 мкм/с, что сравнимо размером самого эритроцита. Таким образом, молекула липида за секунду может «обежать» клетку по периметру. Для белковых молекул среднеквадратичное смещение составляет около 0,2 мкм/с. Соответственно, коэффициенты диффузии для этих молекул составляют D_лип ≈ 6 ∙10^-12 м²/с, D_бел ≈ 1 ∙10^-14 м²/с .

Частота перескоков (число перескоков в секунду ) молекулы при латеральной диффузии рассчитывается по формуле:

v = 2 √ 3 D/ S ,

где S - площадь, занимаемая одной молекулой.

Для молекул фосфолипидов S ≈ 7 ∙10^-19 м², соответственно, v = 3 ∙10⁷ с^-1 . В среднем, каждая молекула липида в составе мембраны, претерпевает несколько миллионов перескоков в секунду. Как видно, время одного перескока занимает 10^-7 - 10^-8 с, такое же как и время оседлой жизни липидной молекулы.

Мембранные молекулы могут также диффундировать и поперек мембраны, т.е. с одной поверхности мембраны на другую. Это тип диффузии называют флип-флоп переходом (диффузией). Диффузия молекул по этому типу происходит значительно медленнее, чем латеральная диффузия. Среднее время флип-флоп перехода одной молекулы фосфолипида составляет около одного часа, в миллиарды раз больше среднего времени молекулы при латеральной диффузии.

Жидкокристаллические структуры очень чувствительны изменению параметров: температуры, давления, химического состава, электрического поля. Этим свойством объясняется высокая динамичность липидных бислойных мембран. Даже небольшие изменения этих параметров сопровождаются структурными перестройками мембран. Наиболее изученным является изменения структуры мембран при понижении температуры, так называемые фазовые переходы. При охлаждении до определенной температуры , фосфолипидная часть мембраны переходит из жидкокристаллического в твердокристаллическое (гелеобразное) состояние. В гель-состоянии молекулы расположены еще более упорядочено, чем жидкокристаллическом состоянии. Углеводородные гидрофобные хвосты липидов располагаются строго параллельно друг другу. Толщина бислоя при таком состоянии несколько больше, чем в жидком кристалле (Рис. 4). Объем занимаемый одной молекулой липида в гель-состоянии (≈0,5 нм²) несколько ниже, чем в жидкокристаллическом (≈0,6 нм²). Температура фазового перехода мембран различных клеток может изменяться от -20 ºС до + 60 ºС. Ее значение зависит от количества ненасыщенных связей в остатках жирных кислот в молекулах липидов: чем больше число ненасыщенных связей, тем ниже температура фазового перехода.

Рис. 3. Схематичное изображение структуры биологической мембраны при фазовом переходе из жидкокристаллического состояния в гель-состояние. (Антонов,26с)

Нормальное функционирование мембран осуществляется в жидкокристаллическом состоянии. Поэтому понижение температуры фазового перехода за счет изменения химического состава мембран является одной из адаптационных механизмов приспособления клеток к низким температурам. Например, значение температуры фазового перехода плазматической мембраны в клетках тканей ноги полярного оленя (от копыта до туловища) изменяется от ­20 ºС до +30 ºС. Это достигается тем, что клеточные мембраны нижней части ноги содержат значительно больше ненасыщенных фосфолипидов, чем мембраны клеток в верхней части ноги оленя.

Экспериментально показано, что при фазовых переходах в липидном бислое образуются сквозные поры радиусом до 3 нм ( табл.1), которые изменяют проницаемость мембран для молекул и ионов. Увеличение проницаемости мембраны при низких температурах является одним из механизмов защиты клетки от криоповреждений. за счет выхода воды из клетки, и соответственно, снижения ее кристаллизации в цитоплазме.