Оценка влияния на морфологию и пролиферацию фибробластов человека с помощью системы для анализа клеток Cellavista

Система для анализа клеток Cellavista. Cellavista представляет собой полностью автоматизированную систему для анализа клеток, которая позволяет получать как флуоресцентные изображения клеток, так и микрофотографии в светом поле. Оптическая система прибора снабжена пятью объективами: 2x, 4x, 10x, 20x and 40x, а также CCD – камерой, которая позволяет получать 4 Мпикс изображения. С помощью Cellavista можно анализировать клетки, помещенные в культуральные планшеты 6, 24, 96-луночные, либо на предметные стекла. Области применения Cellavista: конфлюэнцию и морфологию клеток, клонирование единичных клеток, оценка экспрессии по флуоресценции белков, подсчет и характеристика клеточных ядер, оценка эффективности трансфекции, контроль качества планшетов, подсчет клеток в суспензии, изучение вирусных бляшек, изучение апоптоза, изучение слияния клеток и многие другие функции.

Для получения изображений микропланшет с клетками помещают в устройство и устанавливают настройки изображения (коэффициент усиления, интенсивность и время облучения, фокус). В зависимости от типа анализа могут быть установлены различные параметры для анализа полученных изображений: число клеток, кластеры клеток, колонии и т.д.

Описание образца: Гель для внутрикожных инъекций «НЕОКОЛЛ+» во флаконах по 3 мл. по ТУ 9385-059-05664012-2017, экспериментальная серия.

Линия клеток: DK-4 штамм диплоидных клеток из кожно-мышечной ткани эмбриона человека получен из коллекции ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора. Клетки фибробластоподобные с ядрами овальной формы. Монослойный способ культивирования. Бактерии, грибы, микоплазмы и вирусы в культуре клеток не обнаружены.

Условия культивирования: Клетки выращивали в ростовой питательной среде Игла МЕМ (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Россия) с 10 % сыворотки крови плодов коровы (Gibco, США), 200 мМ L-глютамина, 40 мкг/мл гентамицина в CO2 инкубаторе при 37 ^оС. Посевная концентрация составляла (0,5-1,0)х10⁶ клеток в 1 мл, кратность рассева 1:3, клетки пересевали каждые 3 − 4 суток. Для пересева культур клеток в качестве диспергента применяли 0,25 %-ный раствор трипсина (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Россия) и 0,02 %-ный раствор версена (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Россия) в соотношении 1:2.

Контроли. В качестве контролей использована ростовая питательная среда с 10 % сыворотки. В качестве препарата сравнения использован «Имплантат для подкожного введения NCTF 135 во флаконах объемом 5 мл» производства Filorga S.A.S. 2-4, rue de Lisbonne 75008 Paris (Франция), Регистрационный номер медицинского изделия ФСЗ 2008/02524, а также препарат «Dermaheal HSR» производства Caregen (республика Корея).

Оценка влияния препаратов на морфологию клеток с помощью системы Cellavista. Клетки рассевали в 96-луночные культуральные планшеты в концентрации 7 – 10 х 10³ клеток/лунка, инкубировали в течение 24 часов при 37^оС в увлажненной атмосфере, содержащей 5% двуокиси углерода (стандартные условия). Посевная концентрация клеток устанавливалась с таким расчетом, чтобы воздействие проходило в экспоненциальной (логарифмической) фазе роста клеток. Далее в планшеты вносили препараты в широком диапазоне концентраций (0,7 – 90%) и совместно культивировали в течение 72 часа при стандартных условиях культивирования. После чего планшет с клетками помещали в систему Cellavista, с помощью которой получали изображения клеток в световом поле, используя объектив х20, и анализировали полученные изображения с помощью функции «Cell confluence» (конфлюэнция клеток) программного обеспечения Cellavista software.

Результат исследований: Гель для внутрикожных инъекций «НЕОКОЛЛ+» во всех исследуемых концентрациях не оказывал влияние на морфологию фибробластов человека (рис. 2). Через 72 часа совместного культивирования клеток с препаратом «НЕОКОЛЛ+» во всех исследуемых концентрациях уровень конфлюэнции (% поверхности культуральной посуды, занятой клетками) клеточного монослоя составил 90 – 100 %, также как и в контроле. Тогда как, при добавлении в культуру клеток 22,5 – 90 % препарата сравнения «Dermaheal HSR» (Caregen, Корея) наблюдалось выраженное цитотоксическое действие на клетки, частичная или полная деструкция монослоя клеток, повреждение отдельных клеток и образование клеточного детрита. При совместном культивировании препарата NCTF 135 (Filorga, Франция) изменения морфологии клеток не наблюдалось, однако конфлюэнция клеточного монослоя при культивировании с 90 % этого препарата была снижена до 70 % по сравнению с контролем.

Заключение: Гель для внутрикожных инъекций «НЕОКОЛЛ+» во всех исследуемых концентрациях не вызывал морфологических изменений фибробластов человека и снижение уровня конфлюэнции клеточного монослоя по сравнению с контролем.

Концентрация препарата, %	НЕОКОЛЛ+ (Россия)	NCTF 135 (Filorga, Франция)	Dermaheal HSR (Caregen, Корея)	Контроль
90 %
45 %
22,5 %
11,25 %

Рис. 2. Световая микроскопия фибробластов человека совместно культивированных с препаратом «НЕОКОЛЛ+», а также с препаратами сравнения NCTF 135 (Filorga, Франция) и Dermaheal HSR (Caregen, Корея) в концентрациях: 11,25 %, 22,5 %, 45 %, 90 %. В качестве контроля использована ростовая питательная среда с 10 % сыворотки. Изображения получены с помощью системы Cellavista (объектив х20).

Исследование влияния препаратов на апоптоз и пролиферацию клеток с помощью системы Cellavista.

Влияние препаратов на апоптоз и пролиферацию клеток оценивали путем окрашивания клеток ядерным флуоресцентным красителем Hoechst 33342 [Y. Lee and E. Shacter, J. Biol. Chem., 1999].

Клетки рассевали в 96-луночные культуральные планшеты в концентрации 7 – 10 х 10³ клеток/лунка, инкубировали в течение 24 часов при 37^оС в увлажненной атмосфере, содержащей 5% двуокиси углерода (стандартные условия). Посевная концентрация клеток устанавливалась с таким расчетом, чтобы воздействие проходило в экспоненциальной (логарифмической) фазе роста клеток. Далее в планшеты вносили препараты в широком диапазоне концентраций (0,7 – 90%) и совместно культивировали в течение 72 часа при стандартных условиях культивирования. После этого клетки окрашивали красителем Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich, США) в течении 30 минут при 37 ^oC, после чего клетки трижды отмывали фосфатно-солевым буфером. Система Cellavista была использована для автоматического получения изображений клеток минимум в 6 полях/лунку, используя объектив х20, в световом поле и флуоресцентном канале. Количество апоптотических и делящихся клеток анализировали с помощью программного обеспечения Cellavista software.

.

Live – живые клетки, Apoptotic – клетки в апоптозе.

Рис. 3. Количество живых и апоптотических клеток после совместного культивирования в течение 72 часов с препаратами Biomatrix Meso, NCTF 135, Dermaheal HSR, клетки окрашивали ядерным красителем Hoechst 33342. Изображения получали и анализировали с помощью системы Cellavista.

Результат исследований: гель для внутрикожных инъекций «НЕОКОЛЛ+» значительно стимулировал пролиферацию фибробластов человека в концентрации 11,25 – 90 %, при этом число апоптотических клеток по сравнению с контролем было снижено. Препарат сравнения Dermaheal HSR значительно снижал количество живых клеток в культуре в концентрации 22,5 – 90 % при этом число апоптотических клеток было значительно увеличено. Другой препарат сравнения NCTF 135 (Filorga, Франция) в концентрации 5,6 – 11,25 % стимулировал пролиферацию клеток, а в дозе 45 – 90 % снижал количество живых клеток и увеличивал число клеток в апоптозе.

Заключение: Экспериментально доказано, что гель для внутрикожных инъекций «НЕОКОЛЛ+» стимулирует пролиферацию фибробластов человека, снижая при этом число апоптотических клеток.

ВЫВОДЫ

1. В экспериментах на животных доказано, что гель для внутрикожных инъекций «НЕОКОЛЛ+» в дозе 1 мл/животное нетоксичен.

2. Исследована пирогенность препарата, гель «НЕОКОЛЛ+» в дозе 1 мл/животное непирогенен.

3. Препарат «НЕОКОЛЛ+» стерилен.

4. pH препарата экспериментальной серии препарата «НЕОКОЛЛ+» составляет 7,2 ед.

5. С помощью МТТ-теста доказано, что гель для внутрикожных инъекций «НЕОКОЛЛ+» не оказывал цитотоксическое влияние на фибробласты человека, напротив препарат стимулировал пролиферацию клеток в концентрации от 2,8 – 90 %.

6. С помощью системы Cellavista установлено, что препарат «НЕОКОЛЛ+» во всех исследуемых концентрациях не вызывал морфологических изменений фибробластов человека и снижение уровня конфлюэнции клеточного монослоя по сравнению с контролем.

7. С помощью системы Cellavista показано, что препарат стимулирует пролиферацию фибробластов человека, снижая при этом число апоптотических клеток.

2