2.2 Методика определения группы крови

Определение группы крови системы АВ0:

Работа проводилась по методике определения группы крови при помощи стандартных изогемагглютинирующих сывороток.

Оборудование:

• набор из двух серий четырех групп стандартных изогемагглютинирующих сывороток;

• исследуемая кровь;

• фарфоровые тарелочки или специальные эмалированные металлические пластины со смачиваемой поверхностью;

• изотонический раствор хлористого натрия;

• пипетки;

• стеклянные или пластиковые палочки для перемешивания капель крови и сыворотки.

Определение группы крови производится в помещении с хорошим освещением при температуре от +15 до +25^◦С.

Прежде чем приступить к работе по определению группы крови, необходимо ознакомиться с этикетками стандартных сывороток всех четырех групп. Затем провести макроскопическую оценку пригодности сывороток. На этикетках имеются следующие сведения:

• учреждение, в котором изготовлена сыворотка;

• групповая принадлежность сыворотки с обязательным указанием агглютининов;

• номер серии;

• титр агглютининов, он должен быть не менее 1:32;

• срок годности сыворотки;

• наличие цветных полос: у группы 0(1) – полос нет, у группы А(2) – две синие, у группы В(3) – три красные, у группы АВ(4) – четыре желтые.

Стандартные сыворотки выпускаются с определенной цветовой маркировкой: 0(1) – бесцветная, А(2) – голубая, В(3) – красная, АВ(4) – желтая.

Макроскопически сыворотки должны быть прозрачными, допускается набольшая опалесценция. При наличии помутнения или хлопьев сыворотка считается не пригодной к определению групп крови. Срок годности стандартной сыворотки равняется шести месяцам с момента ее расфасовки.

Определение группы крови проводят на специальных эмалированных металлических пластинках со смачиваемой поверхностью, на которых вверху обозначены группы крови, а под ними размещены два ряда лунок для капель сыворотки и крови. Слева имеется разметка серий сывороток. На пластинках сверху необходимо написать фамилию и инициалы пациента, у которого определяется группа крови.

На сухую пластинку, под соответствующие обозначения групп крови, наносят в лунку по одной большой капле (0,1 мл) стандартной сыворотки (титр 1:32) двух серий; капли второй серии сывороток располагаются во второй ряд. Всегда получается шесть капель. Сыворотку берут из каждой ампулы своей пипеткой и опускают ее в ту же ампулу с сывороткой. Исследуемую кровь размещают в виде крупной капли на пластинке справа. Из нее забирают каплю крови величиной в 10 раз меньше (0,01 мл), чем капля сыворотки. Обычно это делают стеклянной палочкой, погружая ее в каплю исследуемой крови, а затем размещая эту маленькую каплю рядом с каплей стандартной сыворотки. Перемешивание капель крови с сывороткой производят отдельными для каждой капли стеклянными палочками.

После размешивания капель пластинку слегка покачивают, затем оставляют в покое на одну – две минуты, потом снова покачивают. Через пять минут в капле смеси сывороток и эритроцитов, в которых произошла агглютинация, добавляется по одной капле изотонического раствора хлористого натрия для исключения псевдоагглютинации, после чего можно делать заключение о крупе крови.

Если агглютинация произошла, то в каплях смеси сывороток и крови видны невооруженным глазом мелкие красные комочки (агглютинаты), состоящие из склеенных эритроцитов. Иногда эти комочки сливаются в более крупные и становятся похожи на хлопья, а сыворотка становится обесцвеченной.

Если в каплях агглютинация не произошла. То смесь сыворотки и крови остается равномерно окрашенной в красный цвет и в ней не обнаруживается агглютинатов.

С помощью стандартных сывороток мы устанавливаем наличие или отсутствие в исследуемой крови агглютиногенов А и В. В результате такого исследования возможно четыре различных комбинации положительных и отрицательных реакций (табл.3):

1. Если сыворотки всех трех групп дали отрицательную реакцию, то исследуемая кровь принадлежит к первой группе.

2. Наличие агглютинации с сыворотками первой и третей групп крови свидетельствует о принадлежности исследуемой крови ко второй группе.

3. Проявление реакции агглютинации с сыворотками первой и второй групп свидетельствует о принадлежности крови к третьей группе.

4. Если сыворотки всех трех групп крови дали реакцию агглютинации (и она является специфической),то исследуемая кровь принадлежит к четвертой группе. В последнем случае, для исключения неспецифической агглютинации исследуемых эритроцитов, необходимо провести контрольное исследование со стандартной сывороткой четвертой группы, и только при получении отрицательного результата, можно утверждать, что исследуемая кровь принадлежит к четвертой группе.

Таблица 3

Результат реакции со стандартными сыворотками

0αβ(1)	Аβ(2)	Вα(3)	Принадлежность исследуемой крови к группе
- -	- -	- -	0αβ(1)
+ +	- -	+ +	Аβ(2)
+ +	+ +	- -	Вα(3)
+ +	+ +	+ +	АВ(4)

Примечания: «-» - отрицательная реакция; «+» - положительная реакция.

Определение резус-фактора в крови:

Определение в крови резус-фактора проводится с помощью универсального реагента в пробирках без подогрева.

Стандартный универсальный реагент представляет собой смесь сыворотки АВ(4) группы крови и 33% раствора полиглюкина в соотношении 2:1. Его приготавливаю на СПК.

Универсальный реагент не содержит групповых агглютининов, поэтому он может быть использован для определения резус-антигенаD в эритроцитах любой группы крови системы АВ0.

В штатив устанавливают два ряда центрифужных пробирок объемом до 10 мл, по количеству образцов эритроцитов. Дополнительно устанавливают еще две пробирки, для контроля реакции с резус-положительными и резус-отрицательными эритроцитами. Пробирки подписываются.

Во все пробирки первого ряда и две контрольные пробирки вносят по две капли стандартного универсального реагента-антирезус; во все пробирки второго ряда вносят по две капли изотонического раствора хлористого натрия и по одной капле 33% раствора полиглюкина.

В пробирки первого и второго ряда вносят по одной капле исследуемых эритроцитов; в первую контрольную пробирку вносят одну каплю стандартных резус-положительных эритроцитов, во вторую контрольную пробирку – такую же каплю стандартных резус-отрицательных эритроцитов.

Пробирки встряхивают, затем медленно поворачивают по оси, наклоняя почти до горизонтального уровня, чтобы содержимое растеклось по стенкам пробирки, что делает реакцию более выраженной.

Агглютинация может появиться уже на первой минуте, но ожидать необходимо три минуты, так как реакция может быть замедленной. Через три минуты, в пробирки наливают по 2-3 мл изотонического раствора хлористого натрия, перемешивают двух – трехкратным плавным переворачиванием пробирок (не встряхивать). Пробирки просматриваются на свет невооруженным глазом или через лупу, выявляя наличие или отсутствие агглютинации эритроцитов. Образцы эритроцитов, давшие агглютинацию с сывороткой антирезус, считаются резус-положительными, а не давшие агглютинацию – резус-отрицательными.

В контрольных пробах должна произойти аналогичная реакция (Кривов, 2007)