Практикум 5 Питательные среды для культивирования микроорганизмов.

Изучить по раздаточным материалам и тексту практикума различные питательные среды. Ответить на вопросы в конце Практикума письменно в тетради для практических работ.

Среды, применяемые для культивирования микроорганизмов

Каким требованиям должны отвечать питательные среды для выращивания бактерий:

• Должны содержать все элементы, из которых строится клетка, в легкоусвояемой форме для конкретного микроорганизма.

• Питательная среда должна иметь достаточную влажность (не менее 20%)

• Концентрация солей в среде – изотоническая (от 0,5% - для большинства микроорганизмов и максимально для галофильных – 3%).

• Концентрация водородных ионов (рН среды) – оптимальна для выращиваемого микроорганизма (в диапазоне от 4,5 до 8,5)

• Окислительно-восстановительный потенциал среды (Еh) – для анаэробов – 0,120-0,060 В, для аэробов – более 0,080 В (эта характеристика связана с концентрацией кислорода).

• Питательная среда должна быть стерильной.

Классификация питательных сред.

По составу:

• натуральные (имеют неопределенный химический состав),

• полусинтетические и

• синтетические (содержат только химически чистые соединения в установленных дозировках).

По плотности:

• Жидкие (не содержат агар)

• полужидкие (0,2-0,7% агара) и

• плотные (1,5-2% агара).

Агар-агар – полисахарид, получаемый из морских водорослей. Образует в воде гель, плавящийся при 80-86⁰ С и застудневающий при 40-45 ⁰ С. Он не расщепляется большинством микроорганизмов.

По свойствам и назначению:

• простые (основные, универсальные)

• сложные

• специальные* (на основе простых, предназначены для избирательного культивирования определенных видов МО, изучения их свойств).

*К последним относят:

• транспортные

• элективные

• дифференциально-диагностические

Универсальные питательные среды:

Универсальные (общего назначения) - пригодны для выращивания многих видов микроорганизмов и применяются как основа для специальных питательных сред. Примеры: МПБ, МПА, среда Хоттингера, ГРМ, тиогликолевая среда и ряд других.

Мясопептонный агар (мпа) и Мясопептонный бульон (мпб)

Являются основными средами для посевов микроорганизмов, для проверки чистоты культур. Их используют для культивирования и подсчета неприхотливых микроорганизмов. В полужидком виде среда может быть использована для хранения контрольных (эталонных) микроорганизмов.

Состав (г/л):

Пептический перевар животной ткани 5,00

Мясной экстракт 1,50

Дрожжевой экстракт 1,50

Натрия хлорид 5,00

Агар-агар* 15,00

Конечное значение рН (при 25°С) 7,4 ± 0,2

*Не входит для приготовления МПБ

Среда Хоттингера (относится к универсальным накопительным средам)

Предназначена для культивирования различных микроорганизмов, таких как энтеробактерии, синегнойная палочка, стафилококки, некоторые виды стрептококков. При необходимости может быть обогащена углеводами, солями.

Содержит гидролизат Хоттингера, который получают путём ферментативного гидролиза мясного фарша (говяжьего) панкреатином с последующим фильтрованием и добавлением хлороформа в качестве консерванта.

Состав (г/л):

Ферментативный гидролизат животной ткани 5,00

Фосфат калия 10,0

Натрия хлорид 5,00

Агар-агар 15,00

Конечное значение рН (при 25°С) 7,4 ± 0,2

Среда Мюллера-Хинтона

Эту среду используют, например, для культивирования Neisseria sp. (вспомним, какие заболевания вызывают представители этого рода) и для определения чувствительности таких микроорганизмов к антимикробным средствам.

Состав (г/л):

Мясной настой 300,00

Гидролизат казеина 17,50

Крахмал 1,50

Агар-агар 17,00

Конечное значение рН (при 25°С) 7,3 ± 0,2

Специальные среды применяют в тех случаях, когда микроорганизмы не растут на простых средах. К ним принадлежат: кровяной, сывороточный агар, сывороточный бульон, асцитический бульон, асцит-агар и др.

Кровяной агар – разновидность питательных сред, содержащих в составе кровь животных. Предназначен для выделения и культивирования прихотливых микроорганизмов, а также их первичной дифференциации по типу гемолиза. (Вспомнить 3 типа гемолиза за счет гемолизинов микроорганизмов) Примеры видов бактерий с тем или иным гемолизом: наиболее часто α-гемолиз вызывают зеленящие стрептококки, β-гемолиз характерен для листерий, клостридий, а также стафилококков, бета-гемолизирующих стрептококков. γ-гемолиз (гамма-гемолиз) — отсутствие гемолиза.

Элективные (избирательные) – содержат компоненты положительной (оптимальные условия для нужного микроба – такие среды еще называют «среды обогащения») или отрицательной (угнетает другие виды микроорганизмов) селекции. На них одни микроорганизмы растут быстрее и более интенсивно, чем другие виды бактерий. Например, 1 % щелочная пептонная вода является элективной средой для холерных вибрионов, среды Ру и Леффлера – для возбудителей дифтерии.

Кампилобакагар

Селективная среда для кампилобактерий которая состоит из основы кровяного агара с бараньей кровью и антибиотиками*, которые являются селективным компонентом.

*Антимикробные компоненты, существенно подавляют рост нормальной микрофлоры, способствуя росту и выделению из испражнений Campylobacter. Присутствие амфотерицина В в добавке существенно или полностью подавляет рост грибов, а цефалотин усиливает подавление нормальной кишечной микрофлоры.

Основа состав (г/л):

Протеозопептон 15,00

Печеночный перевар 2,50

Дрожжевой экстракт 5,00

Натрия хлорид 5,00

Агар-агар 12,00

Конечное значение рН (при 25°С) 7,4 ± 0,2

*Селективная добавка :

Полимиксин В 1250 МЕ

Ванкомицин 5,0 мг

Триметоприм 2,5 мг

Амфотерицин В 1,0 мг

Цефалотин 7,5 мг

Перед розливом среды в нее добавляют: стерильную лизированную кровь лошади или стерильную дефибринированную баранью кровь (до 10%) и селективную добавку для кампилобактера.

 

Таким образом, селективные среды благодаря селективным добавкам (желчь, краски, антибиотики и др.) способны подавлять развитие одних видов микроорганизмов, но не влияют на другие виды.

Желточно-солевой агар - среда для выделения стафилококков, содержит 7-10% хлорида натрия, что подавляет рост большинства бактерий. Кроме того, эта среда является и дифференциально-диагностической, так как присутствие яичного желтка позволяет выявить фермент лецитиназу (лецитовителлазу), который образуют патогенные стафилококки.

Эту среду используют в качестве селективной для выделения клинически значимых культур стафилококков.

Среда очень питательная ввиду содержания необходимых ростовых факторов. Вместе с тем рост бактерий, кроме стафилококков, подавляется высокой концентрацией (7,5%) хлорида натрия.

Маннит является ферментируемым и дифференцирующим субстратом, а также источником углерода. Добавление яичного желтка дает возможность определить липазную активность микроорганизмов. Эмульсия в солевой среде становится прозрачной, поэтому при наличии липазной активности вокруг колоний формируется мутная желтая непрозрачная зона.