Невідкладна медична допомога в лабораторії

У лабораторії бувають випадки, що вимагають невідкладної медичної допомоги, – порізи рук, опіки гарячими предметами, кислотами та лугами й т.п. При пораненнях склом потрібно насамперед видалити його осколки з рани (якщо вони в ній залишилися) і, переконавшись, що там вони відсутні, змазати рану йодом і перев'язати вражене місце. При термічних опіках першого й другого ступеня обпалене місце необхідно піднести під струмінь холодної води, а потім присипати гідрокарбонатом натрію чи обробити примочками зі свіжоприготовлених розчинів питної соди (2%-й) чи перманганату калію (5%-й). Кращим засобом для примочок є абсолютний чи 96%-ний етиловий спирт. Він виявляє одночасно знезаражуючу й знеболюючу дію. При опіках кислотами та лугами уражене місце варто швидко промити великою кількістю води. Потім на обпалене місце накласти примочку: при опіках кислотою – з 2%-го содового розчину, при опіках лугом – із слабкого розчину оцтової чи борної кислоти.

За умов отруєння газом постраждалого необхідно вивести на свіже повітря і негайно викликати лікаря чи доправити його в медпункт.

Лабораторна робота № 1

Тема: Сучасні методи мікроскопічного дослідження мікроорганізмів. Просте забарвлення.

Мета: Знайомство з особливостями роботи в мікробіологічній лабораторії. Вивчення типів сучасних мікроскопів, освоєння способів мікроскопії, правил роботи з імерсійною системою. Підготовка препаратів живих і фіксованих пофарбованих клітин мікроорганізмів.

Матеріали та устаткування: природні субстрати (кисляк, кефір, настій сіна, біогумусу, розсіл квашеної капусти, цвіль та ін.), мікроскопи МБР, МБД, стерильні піпетки на 1-2 мл, бактеріологічна петля, пінцет, тонкі предметні й покривні стекла, у тому числі з лункою, спиртівка (брикети сухого пального), кювета з містком для фіксованих препаратів, розчини метиленового синього (1:40), фуксину основного, генціанвіолету, імерсійна олія, бензин, серветки, фільтрувальний папір, розчин, що дезінфікує, дистильована вода.

Для вивчення морфології мікроорганізмів у прохідному світлі використовують оптичні мікроскопи МБР (рис. 1.1), МБД.

Механічна частина складається зі штатива з предметним столиком, тубуса, револьвера, механізму наведення різкості, що складається з макрометричного й мікрометричного гвинтів.

Оптична частина мікроскопа містить об'єктив і окуляр. Об'єктив є найважливішою частиною мікроскопа. Він складається із системи лінз, укладених у металеву оправу. Одне з позначень на оправі відповідає значенню збільшення об'єктива. В мікроскопі МБР використовуються об'єктиви, що дають збільшення в 8, 40 і 90 разів. Збільшення об'єктива залежить від фокусної відстані головної – фронтальної лінзи. Чим більша кривизна фронтальної лінзи, тим коротша фокусна відстань, тобто тим нижче потрібно опускати об'єктив над площиною препарату. Інші лінзи називаються корекційними, вони необхідні задля усунення сферичної й хроматичної аберації. Окуляр містить дві лінзи: – очну (верхню) і збірну (нижню). Окуляри можуть давати збільшення в 5, 7, 10, 12, 15 і 20 разів, що зазначено на їхній оправі.

Освітлювальна система включає дзеркало з двома поверхнями (увігнутою та плоскою) і конденсора (у мікроскопі МБД є убудоване джерело світла). Ввігнуте дзеркало збирає й концентрує в площині препарату пучок рівнобіжних променів світла, що йдуть від джерела світла, тому ним користуються в тих випадках, коли працюють без конденсора, тобто з малим збільшенням.

Конденсор, укріплений безпосередньо над дзеркалом, складається з двох лінз і призначений для збирання паралельних променів світла, відбитих дзеркалом, у точці-фокусі, що знаходиться в площині препарату. Вбудована в конденсор ірисова діафрагма слугує для затримання зайвих променів світла і дозволяє при необхідності зменшувати апертуру конденсора.

Загальне збільшення, що дає мікроскоп, визначається добутком збільшення об'єктива на збільшення окуляра. Виразність одержуваного зображення характеризується дозвільною здатністю, що залежить від довжини хвилі використовуваного світла () і суми числових апертур об'єктива (A₁) і конденсора (A₂). Дозвільна здатність мікроскопа – величина, зворотна дозвільній відстані (d), що визначається мінімальною відстанню між двома крапками, коли вони ще не зливаються в одну.

Величина дозвільної відстані мікроскопа визначається наступним чином:

. (1.1)

Числова апертура визначається добутком синуса половини кута охоплення лінзи та показника заломлення середовища (n), що граничить із лінзою: A = sin U·n. Тобто числова апертура характеризується кількістю променів, що попадають у лінзу (рис. 1.2).

Чим більша дозвільна здатність, тим меншої величини об'єкт можна побачити. Світловий мікроскоп за умов використання видимого світла має дозвільну відстань близько 0,2 мкм.

Рис. 1.1. Мікроскоп МБР-1:

1 – основа мікроскопа; 2 – предметний столик; 3 – гвинти для переміщення предметного столика; 4 – клеми для фіксації препарату; 5 – конденсор; 6 – кронштейн конденсора; 7 – гвинт, що закріплює конденсор у гільзі; 8 – гвинт переміщення конденсора; 9 – ручка ірисової діафрагми конденсора; 10 – дзеркало: 11 – тубусоутримувач; 12 – макрометричний гвинт (кремальєра);13 – мікрометричний гвинт: 14 – револьвер; 15 – об’єктиви; 16 – тубус; 17 – гвинт для кріплення тубуса; 18 – окуляр

Рис. 1.2. Схема ходу променів із різною величиною отвірного кута:

А – об’єкт;

О – об’єктив;

 – отвірний кут;

U – половина отвірного кута

Підвищити дозвільну здатність можна двома шляхами: висвітлюючи об'єкт більш короткими променями світла, наприклад, УФ, або, збільшуючи показник заломлення середовища, що граничить із лінзою, для того, щоб наблизити його до показника заломлення скла (n скла =1,5). У вивченні мікроорганізмів майже постійно користуються імерсійним або олієзануреним об'єктивом (90х), що дає збільшення у 900-1350 разів (рис. 1.3). Тому всі промені, не переломлюючись і не змінюючи свого напрямку, потрапляють в об'єктив і забезпечують гарну видимість дрібних об'єктів.

Р ис 1.3. Вплив імерсійної олії на хід променів у мікроскопі:

1 – об’єктив;

2 – предметне скло;

3 – об’єкт;

4 – імерсійна олія;

5 – промені світла;

6 – фронтальна лінза об’єктива

Мікроскопія в темному полі

Для дослідження об'єктів малої величини використовують темнопольну мікроскопію. Для цього в біологічному мікроскопі звичайний конденсор заміняють спеціальним конденсором темного поля, що має затемнену середню частину і пропускає тільки бічні промені. Таким чином, мікроскопія в темному полі заснована на висвітленні об'єкта косими променями світла.

Рис. 1.4. Схема ходу променів у конденсорі темного поля:

1 – лінза конденсора;

2 – чорна пластинка;

3 – об’єктив

Ці промені, не потрапляючи в об'єктив, залишаються невидимими для ока, тому поле зору виглядає зовсім чорним (рис. 1.4). Якщо препарат містить якісь частки, наприклад, м/о, то косі промені, проходячи через такий препарат, у значній мірі відбиваються від поверхні цих часток і, ухиляючись від свого первісного напрямку, попадають в об'єктив. Тоді спостерігач бачить на чорному фоні інтенсивно світні об'єкти з різким бічним контрастом. При цьому апертура конденсора повинна бути трохи більшою апертури об'єктива (об'єктив необхідно діафрагмувати, а конденсор імергувати).

Фазово-контрастна мікроскопія

Більшість препаратів живих м/о слабкоконтрастні, тобто клітини мало відрізняються за забарвленням і прозорістю від навколишнього середовища.

Проте, світлова хвиля набуває певних змін: проходячи через ділянки препарату, що мають більший, ніж у навколишнього середовища показник заломлення, вона виходить із деяким відставанням за фазою. Спеціальний фазово-контрастний пристрій дозволяє оптичним шляхом перетворювати розходження за фазою в зміни амплітуди, у результаті чого живі прозорі об'єкти стають контрастними, їх можна побачити оком.

Оптична система, яка використовується для одержання фазового контрасту, складається з фазової пластинки в одній з лінз об'єктива, що має форму кільця, і кільцевої діафрагми в спеціальному конденсорному пристрої. Для одержання фазового ефекту необхідне точне сполучення фазового кільця з проекцією кільцевої діафрагми (рис. 1.5).

Рис. 1.5. Схема ходу промінів із використанням фазово-контрастного пристрою:

1. – кільцева діафрагма;

2. – конденсор;

3. – об’єкт;

4. – об’єктив;

5. – фазова пластинка

Порядок виконання роботи

1. Ознайомитися з правилами поведінки й техніки безпеки в мікробіологічній лабораторії.

2. Ознайомитися з правилами роботи з чистими культурами мікроорганізмів та методами їхньої мікроскопії.

3. Приготувати й виконати мікроскопічне дослідження прижиттєвих препаратів мікроорганізмів:

Метод «роздавленої краплі»

На чисте знежирене предметне скло мікробіологічною петлею наносять краплю суспензії м/о. Якщо в культурі розвилося дуже багато бактерій, її розводять водою.

Покривне скло ставлять на ребро з краю краплі і поступово опускають на неї. Між стеклами не повинно залишатися пухирців повітря, які заважатимуть мікроскопії. Крапля повинна бути невеликою, щоб після «роздавлення» рідина не виступала за край покривного скла. Препарат розглядають із сухою системою.

Метод «висячої краплі»

Препарат «висяча крапля» використовують для виявлення рухливості м/о. Крім того, можна довгостроково спостерігати за життєдіяльністю м/о: розмноженням, утворенням і проростанням спор.

Для готування препарату невелику краплю суспензії м/о наносять на покривне скло, перевертають його краплею вниз і поміщають на спеціальне предметне скло з поглибленням (лункою) у центрі. Крапля повинна вільно висіти, не торкаючись країв і дна лунки. Край лунки попередньо змазують вазеліном. Крапля виявляється герметично замкненою у вологій камері, що дозволяє багатоденне спостерігання за об'єктом.

Препарати розглядають під мікроскопом, злегка затемнюючи поле зору; конденсор трохи опускають, надходження світла регулюють увігнутим дзеркалом. З невеликим збільшенням знаходять край краплі, що буде чітко видний у затемненому полі зору. Край краплі пересувають у центр поля зору мікроскопа і переводять на велике збільшення, розширивши при цьому діафрагму. Більш чіткі результати можна одержати у мікроскопії у темному полі чи у фазовому контрасті.

Препарат «відбиток»

Ці препарати є зручними для вивчення природного розташування клітин у колонії м/о й особливо для дослідження форми спор і спороносців актиноміцетів і грибів.

З агаризованої пластинки, на якій м/о виросли суцільним газоном, вирізають скальпелем невеликий блок і переносять на предметне скло так, щоб поверхня з м/о була повернена нагору. Потім до газону прикладають чисте покривне скло і негайно знімають, намагаючись не зрушити убік. Отриманий препарат поміщають відбитком униз у краплю води (можна в краплю метиленового синього) на предметне скло і розглядають під мікроскопом із сухою системою. Такий відбиток можна одержати і на предметному склі, якщо торкнутися поверхні колонії предметним склом. Відбитки можна фіксувати й забарвлювати будь-яким способом.

4. Приготувати для мікроскопічного дослідження препарати фіксованих і забарвлених клітин мікроорганізмів простим способом.

Дослідження фіксованих забарвлених препаратів – найбільш розповсюджений мікробіологічний метод для виявлення морфологічних особливостей, кількісного обліку м/о, а також для перевірки чистоти культури. Фіксовані забарвлені препарати можуть зберігатися тривалий час і розглядаються з імерсією. Їхнє готування включає наступні етапи: виконання мазка, висушування, фіксацію й забарвлення.

У простому забарвленні м/о застосовують якийсь один з основних анілінових барвників: метиленовий синій, основний фуксин, генціановий фіолетовий, кристалічний фіолетовий. Профарбовується вся клітина.

Готування мазка

За допомогою стерильної бактеріологічної петлі чи піпетки нанести на знежирене предметне скло краплю суспензії мікроорганізмів.

Матеріал із густого живильного середовища взяти бактеріологічною петлею і внести його в краплю стерильної водопровідної води. Матеріал рівномірно тонким шаром розподілити на площі 1-2 см².

Висушування мазка

Висушити приготовлений мазок при кімнатній температурі у повітрі. Тонкий мазок висихає дуже швидко. Якщо висушування мазка уповільнене, препарат можна злегка нагріти в струмені теплого повітря, тримаючи предметне скло високо над полум'ям пальника мазком нагору. Цю операцію виконують дуже обережно, не перегріваючи мазка, інакше клітини мікроорганізмів деформуються.

Фіксація

Фіксація переслідує кілька цілей: забезпечити прикріплення клітин до скла; зробити мазок більш сприйнятливим до забарвлення, оскільки мертві клітини забарвлюються краще, ніж живі; зробити безпечним подальші маніпуляції з мазком, що важливо в роботі з патогенними мікроорганізмами. Найпростіший і розповсюджений спосіб фіксації – термічна обробка. Після висушування мазок зафіксувати в полум'ї пальника. Тримаючи скло мазком нагору, тричі провести його через гарячу частину полум'я пальника. Щоб уникнути перегрівання, час прямого впливу полум'я не повинний перевищувати 3-4 с. Крім жару фіксацію можна робити хімічними речовинами, для цього використовують 96%-ний етиловий спирт (час фіксації 5-10 хвилин), суміш Нікіфорова (спирт: ефір – 1:1; час фіксації 10-15 хвилин); ацетон (5 хвилин) та ін.

Забарвлення

Фіксований препарат помістити мазком вгору на місток із двох паралельних скляних паличок, з'єднаних гумовими трубками, що знаходяться на стінках кювети чи кристалізатора. Нанести на нього 2-3 краплі барвника (кінець піпетки не повинний торкатися мазка!) на 2-3 хв. Під час фарбування розчин барвника на мазку не повинний підсихати, при необхідності доливати нові порції. Для одержання більш чистих препаратів барвник наливають на мазок, покритий фільтрувальним папером. По закінченні фарбування препарат промивають водою доти, поки стікаюча вода не стане безбарвною. Потім препарат висушують у повітрі і промокають фільтрувальним папером.

5. Виконати мікроскопію з імерсією фіксованого та забарвленого препарату мікроорганізму.

Правила роботи з імерсійним об'єктивом.

Після установлення освітлення приготовлений сухий пофарбований препарат спочатку розглядають із невеликим збільшенням під об'єктивом сухої системи (8х, 40х). Знайшовши найбільш удале місце на ньому, препарат закріплюють затисками на столику мікроскопа. Тубус мікроскопа піднімають і, повертаючи револьвер, установлюють імерсійний об'єктив. Потім у центр препарату на мазок, не знімаючи зі столика мікроскопа, наносять краплю імерсійної (кедрової) олії і, дивлячись збоку, обережно опускають тубус мікроскопа до занурення об'єктива в олію. Стежать за тим, щоб фронтальна лінза не торкнулася предметного скла і не одержала ушкодження. Після цього, дивлячись в окуляр, макрометричним гвинтом повільно піднімають об'єктив до появи в полі зору досліджуваного об'єкта. Фокус уточнюють за допомогою мікрометричного гвинта.

Після роботи кедрову олію негайно видаляють з об'єктива серветкою, що змочена очищеним бензином. Ксилол і спирт використовувати не рекомендується, тому що вони можуть викликати розклеювання лінз об'єктивів.

У правильно забарвленому і добре промитому препараті поле зору залишається світлим і чистим, а пофарбованими залишаються клітини мікроорганізмів.

6. Вивчити препарати. Результати занести до протоколу у вигляді малюнка. Зробити висновки.

7. Препарати, перш ніж вимити, поміщають у посудину з дезінфікуючим розчином.

Лабораторна робота № 2

Тема: Морфологія бактерій.

Мета: Вивчити морфологічну різноманітність прокаріотичних організмів.

Матеріали й устаткування: природні субстрати (кисляк, кефір, настій сіна, біогумусу, розсіл квашеної капусти, гниле м'ясо й ін.) і постійні препарати з культур мікроорганізмів різних морфологічних груп (Streptococcus lactis, Micrococcus lisodeikticus, Lactobacillus acidophylum, Streptomyces recifensis, Lactobacterium plantarum, Bacillus subtilis та ін.), культури актиноміцетів, що виросли на чашках Петрі, мікроскопи МБР, МБД, стерильні піпетки на 1-2 мл, бактеріологічна петля, пінцет, препарувальна голка, тонкі предметні стекла, у тому числі з лункою, покривні скельця, спиртівка (брикети сухого пального), кювета з містком для фіксованих препаратів, крапельниці з фарбами: метиленовий синій (1:40), водний розчин фуксину основного, генціанвіолет, стерильний розчин чорної туші (1:9); імерсійна олія, бензин, серветки, фільтрувальний папір, розчин, що дезінфікує, промивалка з дистильованої водою.

Бактерії складають найбільшу велику і дуже різноманітну групу (понад 1600 видів) мікроорганізмів. Бактерії – це в основному одноклітинні організми, що розмножуються простим поперечним поділом. Морфологічно бактерії розрізняють за формою, взаємним розташуванням клітин, наявністю чи відсутністю джгутиків і капсул, здатністю клітин до спороутворення, і за величиною і т. п.

За формою бактерії поділяються на кілька груп: сферичні, циліндричні, спіральні, незвичайної форми і нитчасті.

Кулясті (сферичні) бактерії – коки (Coccus). Напрямок площини поділу клітин і характер взаємного розташування клітин використовують як систематичну ознаку для виділення родів сферичних бактерій. Діаметр коків 0,5-1,2 мкм.

Моно- чи мікрококи (рід Micrococcus). Їхні клітини поділяються в будь-якій площині і відразу після поділу відокремлюються, розташовуючись поодиноко.

Диплококи (рід Diplococcus) і стрептококи (рід Streptococcus) утворюються у поділі клітин в одній площині; у диплококів клітини розташовуються попарно.

Стрептококи (рід Streptococcus) поділяються також в одній площині, але клітини не відокремлюються одна від одної, а утворюють ланцюжки.

Тетракоки (рід Tetracoccus) виникають за умов поділу клітин у двох взаємно перпендикулярних площинах, клітини утворюють групи по 4 особини.

Сарцини (рід Sarcina) формуються у розподілі клітин у трьох взаємно перпендикулярних площинах, при цьому утворюються пакети з 8-12 клітин і більше.

Стафілококи (рід Staphylococcus) представляють скупчення клітин, що нагадують виноградні грони. Поділ клітин відбувається в будь-якій площині.

Крім правильної кулястої форми, клітини можуть мати овальну чи ланцетоподібну форму (пневмококи), чи бобовоподібну форму кавового зерна (гонококи, менінгококи).

Кулясті бактерії, як правило, не мають джгутиків, нерухомі і спор не утворюють.

Паличкоподібні (циліндричні) бактерії – найчисленніша та різноманітніша група бактерій. Паличкоподібні бактерії розрізняють за величиною клітин, їхнім розташуванням, обрисом кінців клітини, за наявністю чи відсутністю джгутиків. Довжина клітин паличкоподібних бактерій коливається від десятих часток мкм до 10-15 мкм і більше, діаметр клітин від 0,5 до 1,0 мкм.

Більшість паличкоподібних мікроорганізмів – форми безспорові, вони називаються бактеріями (Bacterium, позначають Bact., чи B). Паличкоподібні бактерії, здатні з несприятливих умов формувати спори, прийнято називати бацилами (Bacillus, позначають Bac.). Бактерії й бацили розташовуються поодиноко, чи попарно з'єднуються в ланцюжки, в останньому випадку їх називають відповідно стрептобактерії та стрептобацили. Спори різних бактерій відрізняються за формою, розмірами і положенням в клітині. За умов бацилярного положення спори локалізуються в клітині у центрі, ексцентрально чи термінально і при цьому клітина не змінює свою форму. Під час клостридіального формування спори клітина змінює форму, набуваючи вид човника чи веретена. Ендоспора розташовується в стовщеній частині клітини центрально чи ексцентрально. Плектридіальне положення – це термінальна локалізація спори. У місці її розташування клітина розширюється й здобуває вид барабанної палички чи ракетки. Клостридіальний і плектридіальний типи розташування ендоспор властиві в основному видам роду Clostridium і нерідко зустрічаються в культурі одного виду цього роду.

Звиті (спіральні) бактерії у залежності від форми й кількості витків поділяють на три типи клітин.

Вібріони (рід Vibrio) надані короткими вигнутими паличками у формі коми. Клітини вібріонів вигнуті на 1/3-1/4 обороти. Довжина клітин складає 1-3 мкм.

Спірили (рід Spirillum) – клітини, що вигнуті на 2-3 обороту, мають форму латинської букви S. Розміри клітин у порівнянні з вібріонами значно крупніші – 15-20 мкм.

Спірохети (рід Spirochaeta) надані дуже тонкими довгими клітинами штопороподібної форми з великим числом дрібних витків. Довжина клітин перевищує ширину в 5-200 разів. Число витків спіралі є одним із систематичних ознак для визначення виду.

Нитчасті форми бактерій являють собою ланцюжки циліндричних клітин, часто оточені загальним чохлом.

Актиноміцети – утворюють гіллястий міцелій з довгими та розгалуженими нитками (гіфами), як у цвілевих грибів.

Бактерії незвичайної форми морфологічно різноманітні – тороідальні (замкнені та незамкнені кільця), зіркоподібні, тубероїдальні (паличкоподібні бактерії зі сферичним роздуттям), червоподібні із загостреними кінцями, стеблові, плоскі у вигляді квадратних пластинок або інших геометричних форм.

Багато представників бактерій – рухливі організми. З характеру розташування й числа джгутиків розрізняють монотрихи – бактерії з одним джгутиком на одному з кінців клітини; лофотрихи – бактерії з декількома джгутиками, розташованими на одному з кінців клітини, амфитрихи – бактерії з полярним джгутикуванням на двох кінцях; перитрихи – бактерії з великим числом джгутиків по всій поверхні бактеріальної клітини.

Порядок виконання роботи

1. Для вивчення морфології бактерій заздалегідь приготувати настої різних природних субстратів: м'яса, риби, білка яйця, сіна, борошна, овочів, фруктів та ін. Невелику кількість матеріалу подрібнюють, поміщають у склянку, на кінчику скальпеля додають трохи крейди і заливають водопровідною водою на 2/3 об’єму склянки. Склянку з настоєм витримують у термостаті при температурі 25-28С (чи в теплому приміщенні в темряві 3-5 днів). За цей час у середовищі накопичується маса різноманітних мікроорганізмів.

2. Приготувати та дослідити препарати живих клітин мікроорганізмів із природних субстратів:

• За методом «роздавленої краплі» – із кисломолочних продуктів.

• «Висяча крапля» – із гнилого м'яса, риби, настою біогумусу.

В обох випадках можливе забарвлення об'єкта «прижиттєвими» барвниками – вітальне фарбування. Як прижиттєві барвники можна використовувати метиленовий синій, нейтральний червоний у концентраціях від 0,001 до 0,0001%.

• «Препарат-відбиток» одного з представників актиноміцетів.

Оскільки міцелій актиноміцетів дуже тонкий і довгий, то для вивчення природного розташування клітин цих організмів варто приготувати препарати-відбитки. Покривне скло покласти на поверхню колонії, злегка притиснути до одержання чіткого відбитка, зняти за допомогою пінцета і помістити на предметне скло в краплю води відбитком униз. Паралельно приготовлений таким способом відбиток за аналогією з мазком бактерій висушують, фіксують жаром, забарвлюють і виконують мікроскопію, використовуючи об'єктив 90х з імерсією. Відбиток із такого ж способу можна одержати і на предметному склі.

3. Паралельно з рідини настоїв приготувати фіксовані та забарвлені (простим способом) препарати мікроорганізмів. Зробити мікроскопію спочатку із сухим об'єктивом 40х, потім переглянути, використовуючи імерсійну систему (об'єктив 90х).

4. Для вивчення морфології бактерій приготувати препарати з використанням колекції чистих культур різних морфологічних груп. Препарати розглянути з імерсією, відзначити форму й сполучення клітин різних мікроорганізмів.

5. Приготувати фіксований препарат-мазок із зубного нальоту.

На предметне скло нанести бактеріологічною петлею краплю стерильного фізіологічного розчину чи водопровідної води, потім обережно знімають зубний наліт сірником, розтирають у краплі води та тонким шаром розподіляють на поверхні чистого знежиреного скла. Мазок підсушують у повітрі, фіксують і забарвлюють, розглядають з імерсією.

6. Приготувати прижиттєві препарати з негативним контрастуванням за допомогою рідкої туші з матеріалу будь-якого настою.

Рідкий препарат

На добре знежирене предметне скло мікробіологічною петлею наносять велику краплю досліджуваної культури мікроорганізмів. Суміш ретельно перемішують і накривають покривним склом. Покривне скло обережно притискають до предметного скла смужкою фільтрувального паперу. Виконують мікроскопію препарату, користаючись об'єктивом 40х. На темному фоні туші виявляються прозорі зони капсул навколо різко обкреслених клітин.

Висушений препарат

Краплю туші поміщають на добре знежирене предметне скло і змішують із краплею рідини, що містить бактерії. За допомогою покривного скла розподіляють мазок тонким шаром на поверхні предметного скла. Після того, як препарат висохне у повітрі, виконують його мікроскопію, користуючись об'єктивом МІ-90. У полі зору мікроскопа на загальному темному фоні туші чітко видно незабарвлені клітини мікроорганізмів різної форми, різних розмірів, розташовані в різноманітних сполученнях.

Усі переглянуті під мікроскопом препарати замалювати. Під кожним малюнком указати назву об'єкта, відзначити морфологічні особливості організмів і збільшення мікроскопа, із яким розглядався препарат.

Лабораторна робота № 3

Тема: Морфологія дріжджів, цвілевих грибів і найпростіших.

Мета: Ознайомитися з технікою мікроскопічного дослідження й морфологією різних груп еукаріотичних мікроорганізмів.

Матеріали та устаткування: добові культури дріжджових грибів, що вирощені на чашках Петрі (Candida tropicalis, Saccharomyces cerevisіae), 5-7 добові культури цвілевих грибів (Mucor mucedo, Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Penicillum cyclopium, Blakeslea trispora, Oidium lactis), мікроскопи МБР, МБД, бактеріологічна петля, препарувальна голка, пінцет, тонкі предметні стекла, покривні скельця, суміш спирт + гліцерин (1:1) із додаванням метиленового синього, спиртівка (брикети сухого пального), кювета з містком для фіксованих препаратів, крапельниці з фарбами: метиленовий синій (1:40), водяний розчин фуксину основного, імерсійна олія, бензин, серветки, фільтрувальний папір, розчин, що дезінфікує, промивалка з дистильованою водою.

Гриби – одне з найбільших царств еукаріотичних гетеротрофних організмів, різноманітних із будови й способу життя. Об'єктами мікробіології є одноклітинні мікроскопічні гриби – дріжджі, а також деякі цвілеві гриби.

Дріжджові клітини морфологічно досить різноманітні. Вони бувають округлими, овальними, подовженими та лимоноподібними. Клітини дріжджів значно крупніші бактеріальних і досягають у діаметрі 4-10 мкм. Дріжджові клітини – нерухомі, вони мають клітинну стінку, цитоплазму та яскраво виражене диференційне ядро. Багатьом дріжджам властиве утворення великих скупчень різної форми, деякі дріжджі можуть утворювати рудиментарний міцелій.

На густих живильних середовищах дріжджі ростуть у вигляді різних опуклих безбарвних, жовтувато-жовтогарячих, рожевих, коричневих, бежевих колоній м'якої консистенції, що не вростають у субстрат. Форма й колір колоній мають значення для діагностики дріжджів. Більшість дріжджів розмножуються брунькуванням. До дріжджів, що брунькуються, належать представники роду Saccharomyces. Ряд дріжджів розмножується поділом (Shizosaccharomyces). Дріжджі, в яких спостерігається статевий процес, зв'язаний зі спороутворенням, називаються справжніми дріжджами і належать до аскоміцетів. Аспорогенні дріжджоподібні організми належать до недосконалих грибів (Candida, Torulopsis, Endomyces, Oidium й ін.).

Цвілеві гриби поширені повсюди. Особливо багато їх у ґрунті й у місцях із підвищеною вологістю. Цвілеві гриби мають велике значення як продуценти багатьох цінних речовин – ферментів, антибіотиків, органічних кислот й інших продуктів. За назвою «цвілеві гриби» поєднуються деякі представники зигоміцетів, недосконалих і сумчастих грибів. На густих субстратах цвілі утворюють округлі пухнасті, нитковидні, павутиноподібні, ватоподібні і порошкоподібні колонії зеленого, жовтуватого, чорного чи білого кольору. Колонії цвілі складаються з великої кількості гіллястих ниток, що називаються гіфами. Велика частина гіфів розвивається в повітрі, а частина в товщі субстрату. Система гіфів у цілому утворює міцелій. У порівнянні з розмірами бактерій діаметр ниток більшості цвілі досить великий і коливається від 5 до 50 мкм і більше. Гіфи часто видно неозброєним оком. Міцелій представників зигоміцетів не має поперечних перегородок (септ), міцелій іншої плісені септований. У плісені мається диференційне ядро, причому міцелій зигоміцетів багатоядерний. У зигоміцетів (Mucor) на вільних кінцях плодоносних гіфів (спорангієфорах) в особливих кулястих тільцях (спорангіях) утворюються ендоспори. У представників аскоміцетів і недосконалих грибів (Aspergillus, Penicillium) конідієспори (конідії) також утворюються на вільних кінцях плодоносних гіфів, але є екзогенними, тому що вони не укладені в спорангій, а формуються на поверхні конідієфору, складаючи іноді довгі ланцюжки на зразок намиста. Плодоносні гіфи розташовуються в повітряному міцелії.

Найпростіші (Protozoa) – це одноклітинні організми, що є найбільш просто організованими представниками царства тварин. Морфологічно найпростіші дуже різноманітні. Розміри клітин найпростіших коливаються в широких межах у залежності від видової приналежності і фізіологічного стану. Більшість найпростіших у сотні разів крупніші багатьох бактерій. До найпростіших належить до 15 тисяч видів. З них близько 12 тисяч видів є сапрофітними формами, що живуть у ґрунті та воді, інші – паразитами людини й тварин. Мікробіологи мають справу з обмеженим числом представників, в основному, збудниками різних захворювань людини: дизентерійною амебою, малярійним плазмодієм, окремими видами трипаносом, лейшманіями і деякими іншими.

Порядок виконання роботи

1. Приготувати й виконати мікроскопію клітин дріжджів Saccharomyces cerevisіae, та дріжджоподібних грибів Candida tropicalis, Oidium lactis у препараті «роздавлена крапля» й виконати їхнє прижиттєве забарвлення метиленовим синім у розведенні 1:40. Розглянути клітини дріжджів, що брунькуються й діляться.

Методи виявлення живих і мертвих мікробних клітин засновані на різному прониканні барвника, що характеризується різним фізіологічним станом клітини. Виявлення живих і мертвих клітин грибів виконують на вітальних (прижиттєвих) препаратах за допомогою метиленового синього. Для цього на предметне скло в краплю мікробної суспензії вносять краплю барвника метиленового синього, витримують не більше однієї хвилини, накривають покривним склом, забирають надлишок рідини фільтрувальним папером і виконують мікроскопію у прохідному світлі. Живі клітини, що не пропускають барвник, не забарвлюються, мертві клітини синього кольору.

2. Розглянути колонії грибів Mucor mucedo, Aspergillus niger, Penicillium cyclopium. Колонії грибів розглядають у мікроскоп з об'єктивом 8х безпосередньо у відкритій чашці Петрі.

3. Приготувати препарат «відбиток» одного з представників цвілевих грибів.

4. Приготувати препарат «роздавлена крапля» цвілевих грибів Mucor, Aspergillus, Penicillium і вивчити будову їхніх спорангіїв, конідій і конідієносіїв.

Міцелій грибів погано змочується водою, тому препарат готують у суміші спирту з гліцерином (1:1) чи води з оцтовою кислотою (1:1). Для дослідження грибів на добре знежирене предметне скло наносять краплю суміші. За допомогою двох препарувальних голок у цю краплю обережно переносять шматочок міцелію цвілевого гриба, обережно, не порушуючи структури міцелію, розправляють гіфи та органи, що плодоносять. Перед тим як покласти покривне скло, розглянути препарат із невеликим збільшенням. Потім краплю накривають покривним склом і злегка придавлюють. Дослідження виконують у світловому мікроскопі з використанням об'єктивів 8х і 40х у затемненому полі зору, для чого звужують діафрагму чи опускають конденсор. Для кращої видимості будови міцелію в краплю під покривне скло можна додати невелику кількість фарби (одну краплю фуксину чи метиленової сині). Міцеліальні гриби можуть бути ідентифіковані з характерного спороношення.

У дослідженні культури мукорової цвілі звернути увагу на наявність несептованого міцелію, від якого відходять несептовані спорангієносії з кулястим розширенням угорі (спорангієм), що наповнений ендоспорами.

В аспергілової плісені гіфи септованого міцелію, переплітаючись один з одним, утворюють густу грибницю, від якої відходять одноклітинні конідієносії, що закінчуються віялоподібним розширенням (стерігми зі спорами – конідії).

У пеніцилових плісеней від грибниці відходять септовані конідієносії, що закінчуються пензликами стеригм і конідій (спори).

5. Використовуючи демонстраційний матеріал, ілюстрації й плакати, вивчити та замалювати деякі представники сапрофітних і паразитарних форм найпростіших.

По закінченні роботи предметні та покривні стекла із препаратами перш, ніж вимити, продезінфікувати. Результати спостережень відобразити у вигляді малюнків. Указати назву об'єкта, відзначити морфологічні особливості організмів.

Лабораторна робота № 4

Тема: Будова бактеріальної клітини. Диференційні методи забарвлення.

Мета: Вивчити будову прокаріотичних організмів, оволодіти складним методом забарвлення за Грамом.

Матеріали та устаткування: культури мікроорганізмів, що вирощені на агаризованому середовищі: Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus, Streptococcus lactis, Saccharomyces cerevisiae та ін., мікроскопи МБР, МБД, стерильні піпетки, бактеріологічна петля, пінцет, препарувальна голка, тонкі предметні стекла, покривні скельця, спиртівка (брикети сухого пального), кювета з містком для фіксованих препаратів, крапельниці з фарбами, 96-ний спирт, імерсійна олія, бензин, серветки, фільтрувальний папір, розчин, що дезінфікує, промивалка з дистильованою водою.

Барвники для забарвлення за Грамом:

1. Феноловий розчин генціану фіолетового: генціан фіолетовий – 1 г, спирт 96%-ний – 10 мл, фенол кристалічний – 2 г, вода дистильована – 100 мл.

2. Розчин Люголя: йодид калію –2 г, йод кристалічний – 1 г, вода дистильована – 300 мл. Спочатку готують концентрований розчин йодиду калію в 5 мл води, у ньому розчиняють йод, потім додають воду до 300 мл.

3. Фуксин Пфейфера: 1 мл карболового фуксину Циля і 9 мл дистильованої води.

Мікробна клітина – складна жива система, що характеризується високим ступенем упорядкованості складових її структур; кожна структура має певну життєву функцію та їхня взаємодія між собою забезпечує існування клітини, її цілісність.

Для вивчення внутрішньої будови клітин застосовують спеціальні методи забарвлення – цитохімічні методи дослідження. Багато з цих методів переслідують діагностичні цілі. За формою клітини м/о не занадто різноманітні, та в ряді випадків, щоб установити приналежність мікроба до того чи іншого роду й виду, необхідно виконати спеціальне забарвлення клітини чи речовини, що накопичується в ній.

Порядок виконання роботи

1. Вивчити ультраструктуру бактеріальної клітини.

Розглянути мікрофотографії мікроорганізмів, що одержані за допомогою електронного мікроскопа. Замалювати схематичну будову узагальненої бактеріальної клітини (додаток 1).

2. Забарвити бактерії за Грамом.

Забарвлення за Грамом є найбільш універсальним із диференціальних методів забарвлення мікробних клітин. Він заснований на розходженні в хімічному складі клітинних оболонок і має важливе діагностичне значення у визначенні видів бактерій. Усі бактерії щодо цього методу забарвлення поділяються на грампозитивні й грамнегативні.

Сутність зафарблення полягає у тому, що грампозитивні утримують комплекс генціанового фіолетового з йодом під час обробки препарату спиртом і тому забарвлюються в синьо-фіолетовий колір. У грамнегативних м/о це сполучення з'являється тимчасово і знебарвлюється після обробки спиртом. У наступному забарвлюванні фуксином вони здобувають рожево-червоний колір. Здатність клітин забарвлюватися за Грамом залежить від віку культури: у старій культурі мертві клітини завжди забарвлюються грамнегативно. Деякі бактерії (коринебактерії, протей) зафарблюються грамваріабельно. Фарбувати за Грамом необхідно клітини молодих (частіше однодобових) культур. Доцільно також офарблювати клітини контрольних мікроорганізмів, відношення яких до забарвлення за Грамом заздалегідь відоме. Мазок для зафарбовування за Грамом повинний бути тонким, щоб клітини рівномірно розподілялися на поверхні скла і не утворювали скупчень.

Техніка зафарбування за Грамом

На добре знежиреному предметному склі готують три тонких мазки різних культур мікроорганізмів: у центрі наносять мазок досліджуваного мікроорганізму (чи суміші грамнегативних і грампозитивних бактерій), по краях – контрольних культур. Клітини однієї контрольної культури повинні бути грампозитивними.

Мазки висушують у повітрі і фіксують над полум'ям пальника. Фіксація хімічними сполуками не рекомендується.

На фіксований мазок наливають розчин карболового генціанового чи кристалічного фіолетового. Мазки зафарблюють протягом 1 хвилини.

Барвник зливають і, не промиваючи препарат водою, обробляють його розчином Люголю протягом 1 хвилини до повного почорніння.

Зливають розчин Люголю і препарат, не промиваючи водою, обробляють із безперервним погойдуванням 96%-ним етиловим спиртом протягом 15-20 с. Час знебарвлення дуже істотний, за умов перебільшення зазначеного терміну знебарвлюються і грампозитивні клітини, якщо термін обробки скорочений препарат виявиться перефарбованим.

Промивши препарат водою, його додатково офарблюють протягом 1 хвилини водяним фуксином Пфейфера. Барвник зливають, препарат знову промивають водою, висушують і виконують мікроскопію з імерсійною системою. Грампозитивні бактерії за умов правильного зафарбування набувають синьо-фіолетовий колір, грамнегативні – червоно-рожевий колір фуксину.

Метод Грама в модифікації Синєва

На фіксований мазок накладають смужку фільтрувального паперу шириною 3 см, що попередньо просочений 1%-ним розчином кристалічного фіолетового та висушений (у висушеному вигляді папір може довго зберігатися). На папір наносять 2-3 краплі води і залишають його на препараті 2 хв. Надалі фарбування проводять за вищеописаною методикою. Модифікація Синєва знайшла широке застосування в практиці.

Метод Грама в модифікації Калини

На предметне скло наносять невелику краплю дистильованої води, поміщають у неї мінімальну кількість клітин мікроорганізмів і петлею додають 0,5%-ний спиртовий розчин кристалічного фіолетового. Суспензію рівномірно розподіляють на площі 1 см², підсушують і фіксують однократним проведенням над полум'ям пальника. Після цього препарат протягом 1 хвилини обробляють реактивом, що містить 10 мл 5%-ного розчину фуксину Пфейфера, 10 мл 10%-ного розчину йоду, 10 мл ацетону і 70 мл 0,5%-ного йодиду калію. Потім препарат опускають на мить у 96%-ний етиловий спирт і швидко висушують фільтрувальним папером.

Результати спостережень відобразити у вигляді малюнків. Указати назву об'єкта, відзначити морфологічні особливості організмів.

Препарати, перш ніж вимити, поміщають у дезінфікуючий розчин.

Лабораторна робота № 5

Тема: Методи стерилізації.

Мета: Ознайомитися з принципами й методами стерилізації, засвоїти правила підготовки посуду й інструментів до стерилізації.

Матеріали та устаткування: вата гігроскопічна, марля (бинт), нитки, ножиці, скляні палички, піпетки градуйовані ємністю 1, 2, 5 і 10 мл, колби конічні й круглі плоскодонні (колби Виноградського, колби Ерленмейєра) ємністю 250, 500, 1000 мл, чашки Петрі, металеві пінцети, крафт-папір, олівці для скла, спиртівки (сухе пальне), бактеріологічні петлі, шпателі Дригальського, автоклав, сушильна шафа.

Стерилізація є одним із найважливіших і необхідних прийомів у мікробіологічній практиці. Культивування організмів здійснюється обов'язково в стерильних умовах. Під стерилізацією чи знеплідненням розуміють повне знищення живих мікроорганізмів та їх живильних форм (спор) у живильних середовищах, посуді, сухих матеріалах, на інструментах й інших предметах лабораторного устаткування.

Існують різні методи стерилізації: фізичний, механічний і хімічний.

Фізичні методи стерилізації:

• прожарювання в полум'ї;

• стерилізація сухим жаром (гарячим повітрям у сушильній шафі);

• стерилізація кип'ятінням;

• стерилізація насиченою парою під тиском (автоклавування);

• дробова стерилізація (тиндалізація);

• стерилізація ультрафіолетовим опроміненням.

Хімічний метод стерилізації:

• дезінфекція антисептиками.

Механічний метод стерилізації:

• фільтрування за допомогою мембранних фільтрів і фільтрів Зейтця.

Можливість та доцільність застосування того чи іншого способу визначається особливостями матеріалу, що підлягає стерилізації, його фізичними й хімічними властивостями, метою дослідження.

Найчастіше в мікробіологічній практиці застосовується термічна стерилізація.

Стерилізація випалюванням у полум'ї пальника

Невеликі скляні й металеві предмети (голка, петля, пінцет, скальпель, палички, шпатель) стерилізують прожарюванням у полум'ї безпосередньо перед використанням. Стерилізація досягається обвуглюванням мікроорганізмів, що знаходяться на їхніх поверхнях. Випалюванням у полум'ї користуються для стерилізації поверхні ватяних пробок, горла посуду.

Стерилізація в автоклаві парою під тиском

Найбільш надійний і універсальний метод стерилізації живильних середовищ і матеріалів – стерилізація їхньою насиченою парою під тиском вище атмосферного. Підвищений тиск пари створюється у спеціальних герметично закритих товстостінних апаратах (автоклавах). Предмети, що підлягають стерилізації в автоклаві, загортають у папір. Повна стерилізація живильних середовищ забезпечується нагріванням протягом 20 хвилин за умови 120С і надлишкового тиску 1 атм.

Стерилізація кип'ятінням

Стерилізацію металевих інструментів і гумових трубок виконують кип'ятінням. Спори деяких бактерій зберігають життєздатність під час кип'ятіння у дистильованій воді протягом декількох годин, тому рекомендується стерилізацію кип'ятінням виконувати у 2%-ному розчині карбонату натрію протягом 10 хв. У цих умовах спори гинуть.

Стерилізація сухим жаром

Сухим жаром стерилізують, в основному, скляний посуд. Щоб уникнути зараження предметів, що простерилізовані, із повітря, їх перед стерилізацією загортають в обгортковий папір і виймають із неї тільки перед роботою.

Стерилізація текучою парою. Дробова стерилізація, або тиндалізація

Живильні середовища (молоко, солод, желатину), воду, гумові трубки й інші предмети, що псуються від дії сухого жару, піддають стерилізації текучою парою. Стерилізації текучою парою роблять у кип'ятильнику Коха чи в автоклаві з відкритим вентилем. Воду в них доводять до кипіння, і пара, що утвориться, обтікає об'єкти. Температура живильних середовищ, що стерилізуються, досягає 100С. Нагрівання протягом 30-45 хвилин призводить до загибелі вегетативних клітин бактерій, але спори їх не гинуть. Наступного дня нагрівання повторюють. За цих умов гинуть вегетативні клітини, що розвилися зі спор. Для забезпечення повної стерильності рідину залишають ще на добу і знову повторюють нагрівання. Таку стерилізацію називають дрібною, або тиндалізацією.

Пастеризація

В основі пастеризації полягає нагрівання рідин до температури менше 100С. Мета її – знищення безспорових бактерій у рідинах, що втрачають живильні властивості під час кип'ятіння (молоко, пиво, вино та ін.). Здійснюється пастеризація нагріванням рідин при 60С упродовж 30 хвилин, чи при 75С упродовж 15 хвилин, або при 80С упродовж 10 хв.

Холодна стерилізація

Органічні рідини, що не виносять нагрівання, звільняють від бактерій, пропускаючи через стерильні дрібнопористі фільтри. Ці фільтри затримують мікроорганізми, їх називають бактеріальними фільтрами. Бактеріальні фільтри мають різні номери. Фільтри № 1 мають середній діаметр пір 0,3 мкм, вони найбільш надійні. Перед уживанням мембранні фільтри стерилізують кип'ятінням. Фільтри поміщають у теплу дистильовану воду і кип'ятять 30 хвилин, змінюючи її 2-3 рази.

Предмети, що виготовлені з термолабільних пластмас, наприклад, центрифужні пробірки, стерилізують ультрафіолетовими променями. Час опромінення встановлюють експериментально. Воно залежить від потужності бактерицидної лампи й відстані між лампою й об'єктом.

Порядок виконання роботи

1. Ознайомитися з режимами стерилізації живильних середовищ посуду й інструментів (Додаток 2).

Живильні середовища стерилізують, головним чином, автоклавуванням, що виконують за різними режимами. Коли вказують режим стерилізації в одиницях тиску, мають на увазі додатковий тиск.

Температура та тривалість автоклавування визначається насамперед складом живильного середовища. Субстрати, що містять речовини, які не витримують нагрівання до 120С, стерилізують із тиском 0,5 атм. Молоко, дріжджовий автолізат, середовища із желатиною стерилізують з тиском 0,5 атм. протягом 15 хв. Середовища, що містять цукри і вітаміни, наприклад, пивне сусло, соки, стерилізують із тиском 0,5 атм. 20-30 хв. МПБ і МПА автоклавують із тиском 1 атм. 20-30 хвилин, картопляне середовище і ґрунтову витяжку – тиском 1,5 атм. 30 хв.

2. Виготовити ватно-марлеві пробки для пробірок і колб різної ємності.

Ватно-марлеві пробки оберігають посудини із середовищами від зараження мікрофлорою, що знаходиться в навколишньому повітрі. Кращою ватою для виготовлення пробок є гігроскопічна вата. Правильно виготовлена пробка повинна легко входити в пробірку (колбу) і щільно прилягати до її стінок, не порушуючи газообміну між вмістом посудини і зовнішнім середовищем. Після витягання із посудини форма пробки не повинна змінюватися.

Для виготовлення пробки плоский шматок вати скачують валиком. Щоб додати пробці міцність, її прокочують між долонями або між долонями і чистим склом, що лежить на столі. Довжина пробки для звичайної пробірки повинна бути близько 4 см. Пробка повинна входити в пробірку на 1,5-2 см. Для збереження форми пробку виймають із горлечка, злегка обертаючи. Зручно обгорнути пробку чистою марлевою серветкою.

3. Підготувати до стерилізації мікробіологічні пробірки, піпетки, чашки Петрі, шпателі Дригальського.

Основним способом стерилізації скляного посуду є обробка гарячим повітрям у сушильних шафах. Посуд перед стерилізацією ретельно миють, сушать і загортають у папір для збереження стерильності після прогрівання.

Пробірки, колби попередньо закривають ватно-марлевими пробками. Пробірки поєднують по 15-20 штук і загортають у папір.

Кожну піпетку загортають окремо в довгі смужки паперу шириною 3-4 см. Попередньо в кінець піпетки, що беруть у рот, вкладають ватяний тампон. Обмотування починають із протилежного кінця. Капілярний кінець піпетки кладуть на смужку паперу під кутом 45 і загортають за спіраллю. Загорнені піпетки для запобігання від забруднення й розривів загортають кілька штук разом.

Шпателі обгортають окремо, а потім, як і піпетки, поєднують.

Чашки Петрі загортають у папір у формі квадрата. Чашку Петрі поміщають на середину аркуша, загинають його з двох протилежних сторін догори, край двічі загинають швом. Два вільних кінці загинають униз. Таке обгортання чашок дає можливість легко розрізняти верх і низ. Дві-чотири чашки Петрі загортають разом.

Підготовлений таким способом посуд поміщають у сушильну шафу і прогрівають при температурі 160-170С упродовж 2 годин. У таких умовах гинуть не тільки бактерії, але і їхні спори. Температуру в сушильній шафі вище 175С допускати не слід, тому що це призведе до побуріння ватяних пробок, а паперова обгортка стає ламкою.

Простерилізувати прожарюванням у полум'ї Простерилізований посуд зберігають у закритому, захищеному місці. Розгортають її безпосередньо перед використанням.

4. Підготувати до стерилізації бактеріологічні петлі, голки, гачки.

Узяти бактеріологічну петлю у праву руку й у горизонтальному положенні внести її у нижню, найбільш холодну частину полум'я, а потім перенести в положення, близьке до вертикального, і нагріти до червоності у верхній частині полум'я пальника спочатку нижню, потім верхню частину дроту і пропалити петлеутримувач. Прожарювати в цілому 5-7 с.

Лабораторна робота № 6

Тема: Фізіологія мікроорганізмів. Живильні середовища для вирощування мікроорганізмів. Культивування мікроорганізмів. Одержання накопичувальних культур.

Мета: Ознайомитися з потребами мікроорганізмів у живильних речовинах і принципами складання живильних середовищ для їхнього вирощування. Приготувати рідкі й густі (натуральні та синтетичні) живильні середовища, засвоїти правила підготовки живильних середовищ до стерилізації. Засвоїти методи одержання накопичувальних культур різноманітних фізіологічних груп мікроорганізмів із подальшим виділенням чистих культур.

Матеріали й устаткування: несхмелене пивне сусло, пептон, агар-агар, дріжджі, картопля, вівсяні пластівці, молоко, сироватка, желатин та інші компоненти для готування живильних середовищ, колби Виноградського, колби Ерленмейєра, мікробіологічні пробірки з ватно-марлевими пробками, циліндри, ваги технічні, електроплитка, скляні палички, піпетки, крейда, NaCl, вата, марля, фільтрувальний папір, лійки, автоклав. Бульби картоплі, сіно, дріжджі, молоко, пиво, розсіл капусти або огірків, ножиці, конічні колби на 250 мл, мікробіологічні пробірки, крейда, вата, електроплитка, водяна баня, чашки Петрі, фільтрувальний папір.

Мікроорганізми розрізняються з хімічного складу, типу живлення, дихання, способу одержання енергії, розмноження, стійкості до факторів навколишнього середовища. Живлення є найважливішою функцією мікроорганізмів. Як і всім іншим організмам, їм необхідний набір різних хімічних елементів. Для накопичення, виділення, культивування й збереження мікроорганізмів користуються живильними середовищами. До складу цих середовищ включені живильні речовини, що необхідні у здійсненні обміну між бактеріальною клітиною та середовищем. Обмін речовин мікроорганізмів (бактерій) включає два основних процеси – одержання енергії (енергетичний обмін) і біосинтез речовин клітини (конструктивний обмін). Ці два обміни являють собою різні сторони єдиного метаболізму.

Мікроорганізми повинні бути забезпечені джерелом енергії й одержувати ззовні в необхідних кількостях елементи, що входять у їхній склад для здійснення біосинтезу, розмноження і росту. Це – біогенні (С, О, Н, N); зольні елементи (Р, S, K, Mg, Ca, Fe) і мікроелементи, що стимулюють ріст клітинної маси (у малих дозах) – Zn, Mn, B, Cu, Mo, Co та ін.

У мікробіологічній практиці для вирощування мікроорганізмів використовують різноманітні живильні середовища, які за складом поділяють на природні, або натуральні, напівсинтетичні й синтетичні середовища.

Натуральні середовища складаються з продуктів рослинного й тваринного походження – м'яса, молока, картоплі, моркви, овочевих і фруктових соків, молочнокислої сироватки, відварів, екстрактів, отриманих із природних субстратів.

Прикладами натуральних середовищ можуть слугувати:

• м’ясопептонний бульйон, що складається з екстракту м'яса (500 м м'яса на 1 л води), 0,5% NaCl і 1% пептону (продуктів неповного розкладання білка);

• несхмелене пивне сусло, яке приготовлене на основі солоду (пророслих зерен ячменю) і містить цукри;

• дріжджове середовище, що складається з екстракту дріжджів (7-10 г сухих дріжджів на 1 л води), до якого додають вуглеводи (1-2%), мінеральні солі К₂НРО₄ (0,1%); і NaCl (0,5%);

• картопляне середовище – відвар картоплі (200 г картоплі на 1 л води);

• витяжки з ґрунту та ін.

На натуральних середовищах добре розвиваються багато мікроорганізмів, тому що в таких середовищах маються, як правило, усі компоненти, необхідні для їхнього росту.

Для вирощування мікроорганізмів, що використовують органічні форми азоту, найчастіше вживають м’ясопептонні середовища: м’ясопептонний бульйон (МПБ), м’ясопептонний агар (МПА) і м’ясопептонну желатину (МПЖ).

Солодове (несхмелене пивне) сусло – гарне середовище для деяких молочнокислих і оцтовокислих бактерій, дріжджів, мікроскопічних грибів і інших представників гетеротрофних організмів. Основні компоненти сусла – вуглеводи й азотовмісні речовини.

Несхмелене пивне сусло, що отримують із пивоварного заводу, розбавляють водою до 6-7 за Баллінгом і використовують для культивування багатьох мікроорганізмів. Якщо готове сусло відсутнє, користуються солодовим середовищем, що готують у такий спосіб. Зернівки ячменю пророщують до накльовування, потім висушують їх при температурі 60-70С і мелють на кавовому млині. Нагрівають 1 л води до 50С і, перемішуючи, всипають у неї 250 г меленого солоду. Залишають у воді без нагрівання на 30 хвилин, потім воду нагрівають і підтримують температуру 55-58С. Час від часу з рідини беруть проби на крохмаль (йодна проба). Коли йодна проба покаже повне оцукрювання крохмалю, сусло фільтрують і потім стерилізують тиском ½ атм. протягом 30 хвилин (так само стерилізують готове сусло). Варто мати на увазі, що для культивування дріжджів використовують сусло, яке містить 6-8% цукру, а для молочнокислих бактерій – 8-12%, тому у суслі потрібно визначити вміст цукру. Сусло стерилізують температурою 115С і тиском 0,5 атм. упродовж 30 хв.

Для фільтрування агарових середовищ застосовують ватно-марлевий фільтр. Для його готування скляну лійку покрити марлевою серветкою такої величини, щоб кінці серветки були перекинуті через край лійки назовні, потім на марлю покласти шар гігроскопічної вати і змочити фільтр гарячою дистильованою водою. Агаризоване середовище налити на фільтр у гарячому вигляді. Процес фільтрації виконувати в нагрітій водяній бані.

Після фільтрації живильні середовища розливають у посудини (колби Ерленмейєра ємністю 250 мл). Наливати треба не вище 2/3 висоти посудини. Посуд заздалегідь ретельно миють, висушують, закривають ватно-марлевими пробками, що убезпечує середовище від зараження мікроорганізмами, які знаходяться в навколишньому повітрі. Тому пробки повинні бути досить щільними, з рівномірним розподілом волокон вати. Не можна обертати пробки посудин, що будуть стерилізуватися в автоклаві, целофаном чи іншими матеріалами, що не пропускають пару. Пара повинна обов'язково проникати через пробку в посудину, інакше середовища не нагріються до потрібної температури і не простерилізуються. Посуд необхідно заздалегідь простерилізувати, якщо налиті в нього середовища стерилізують текучою парою чи тиском не більше 0,5 атм. Якщо ж живильні середовища стерилізують під тиском вище 1 атм., то попередня стерилізація посуду необов'язкова.

Середовище з агаром нагрівають на киплячій водяній бані до повного його розплавлення. Якщо передбачається вирощування мікроорганізмів на скошеному агаризованому середовищі в пробірках, то кожну пробірку заповнюють середовищем не більше, ніж на 1/3. Для розливання живильних середовищ користуються лійкою. Потрібно стежити за тим, щоб край пробірок чи флаконів не був змочений живильним середовищем, тому що ватно-марлеві пробки можуть приклеїтись до скла під час стерилізації і будуть важко вийматися, ускладнюючи процес роботи.

Зверху ватно-марлевої пробки на колби й флакони варто надіти паперові ковпачки й підписати назву живильного середовища та дату її готування.

Щоб середовище не підсихало, його скошують після стерилізації, перед посівом. Для цього пробірки з розплавленим на киплячій водяній бані середовищем установлюють у похилому положенні і дають середовищу застигти. Скошене гаризоване середовище не повинне доходити до ватяної пробки на 4-6 см. Середовище, що призначене для культивування бактерій у чашках Петрі, розливають по 15-20 мл у пробірки більшого об’єму, ніж для скошеного агаризованого середовища, чи стерилізують у колбах. В останньому випадку до стерилізації агар не розплавляють.

Іноді для культивування мікроорганізмів використовують напівсинтетичні середовища:

МПБ із 2%-ним розчином глюкози; дріжджовий автолізат із солями амонію й вуглеводами у певному співвідношенні. Ці середовища широко використовують для одержання вітамінів, антибіотиків, амінокислот й інших продуктів.

Синтетичні середовища, що включають тільки відомі хімічно чисті речовини, у точно зазначених концентраціях: середовище Виноградського для нітрофіксуючих бактерій, глюкозомінеральне середовище для Achromobacter.

Синтетичні середовища бувають простими за складом чи мають великий набір щодо компонентів. Їх широко використовують для вивчення обміну речовин мікроорганізмів.

За призначенням розрізняють елективні й диференційно-діагностичні середовища.

Елективні (виборчі) середовища забезпечують переважний розвиток одного виду чи групи родинних мікроорганізмів: середовище Чапека (для актиноміцетів), середовище Врублевського, Кітта-Тароцци (для анаеробів), МПА з новобіоцином (для сапрофітних стафілококів, стійких до новобіоцину). Диференційно-діагностичні (індикаторні) середовища, що досить добре дозволяють відрізнити одні види мікроорганізмів від інших: середовище Ендо (для кишкових бактерій), вуглеводні середовища, до складу яких входять різні вуглеводи з індикатором.

З фізичного стану (консистенції) живильні середовища розділяються на: рідкі (МПБ), густі (МПА), сипучі (розварене пшоно, висівки, що просочені живильним розчином).

Для з'ясування фізико-біологічних особливостей мікроорганізмів, а також для накопичення їхньої біомаси чи продуктів обміну найзручніше застосовувати рідкі середовища.

Напіврідкі середовища готують, додаючи 0,1-0,2% агар-агару. Агар-агар – рослинний колоїд, що одержують із деяких морських водоростей (складається в основному з полісахаридів, включає азотисті речовини).

Сипучі середовища іноді застосовують у промисловій мікробіології. До них належать, наприклад, розварене пшоно, висівки, кварцовий пісок, просочені живильними розчинами.

Густі (тверді) середовища використовують для виділення чистих культур (одержання ізольованих колоній), у діагностичних цілях: опис колоній, встановлення характеру росту на скошеному МПА та ін., для збереження культур, для кількісного обліку мікроорганізмів, визначення їхніх антагоністичних властивостей. Густі середовища готують із рідких, додаючи для згущення агар-агар (1,5-2,5%), желатину (10-15%) чи кремнекислий гель, Найчастіше в мікробіологічній практиці для згущення середовищ використовується агар-агар. Це складний полісахарид, більшість мікроорганізмів не використовують його як живильний субстрат. У воді агар-агар утворює гелі, які плавляться при температурі 100С, що твердіє при температурі близько 40С. Желатина – білок, що одержують у процесі виварювання кісток і хрящів тварин. Желатину до рідких середовищ додають у кількості 10–15% (желатиновий гель плавиться при 23-26С).

Культивування мікроорганізмів

Вирощування мікроорганізмів на живильних середовищах називається культивуванням, а розвинені мікроорганізми, отримані від тварини, людини, чи рослини, субстрату зовнішнього середовища, – культурою. Розвиток культури м/о в рідкому середовищі призводить до утворення суспензії або осаду, плівки, на твердому середовищі – колонії. Культивування за умов певної температури (у термостаті) називається інкубацією.

У мікробіологічній практиці широко використовуються як чисті культури мікроорганізмів, так і консорціуми.

Для вивчення фізіолого-біологічних особливостей розвитку бактерій, а також для встановлення їхньої видової приналежності необхідно виділяти чисті культури, що складаються з мікроорганізмів одного виду.

Консорціуми – змішані чи асоціативні культури, що складаються з 2-х і більше мікроорганізмів, між якими існують різні форми взаємин.

Чиста культура мікроорганізмів одного виду, що виділена з певного джерела і відрізняється від інших представників виду незначними змінами, називається штамом. Чиста культура мікроорганізмів, що є потомством однієї єдиної клітини, називається клоном.

Виділення чистої культури здійснюють поетапно:

• одержання накопичувальної культури;

• виділення чистої культури з ізольованих колоній за методом Коха;

• визначення чистоти культури, що виділена, та вивчення культуральних властивостей;

• ідентифікація мікроорганізмів із різних властивостей: морфологічних, тинкторіальних, біохімічних (ферментативних), антигенних і т. п.

Накопичувальними культурами називаються культури, які складаються переважно з клітин одного виду.

Для одержання мікроорганізмів визначених фізіологічних груп Виноградським запропонована техніка «накопичувальних культур», заснована на використанні елективних (виборчих) середовищ, що забезпечують переважний розвиток визначених бактерій. Інші організми в цих умовах не можуть розмножуватися чи їхній ріст буде дуже незначний.

Внесення клітин мікроорганізмів (зразка ґрунту, проби води) у стерильне живильне середовище для одержання накопичувальної чи чистої культури називається посівом, чи інокуляцією. Для одержання накопичувальних культур кращим матеріалом для інокуляції слугують субстрати, в яких відбувається їх природне «збагачення».

Елективні умови передбачають ряд факторів, наприклад, потреба м/о у живильному субстраті, відношення до кисню, кислотності середовища, температури, здатність до спороутворення і т. д.

Підбираючи оптимальний склад живильного середовища та параметри культивування й інокулюючи середовище якими-небудь природними субстратами, що містять різноманітні м/о, можна одержати накопичувальну культуру організмів, що характеризуються певними фізіолого-біохімічними властивостями. З накопичувальних культур виділяють чисту культуру м/о.

Порядок виконання роботи

1. Ознайомитися з рецептурами різних натуральних і синтетичних живильних середовищ (Додаток 3).

2. Приготувати густе живильне середовище на основі сусла.

Сусло-агар (СА) є прекрасним середовищем для молочнокислих бактерій і дріжджів. Для одержання твердого сусло-агару до пивного сусла додають 2% агару. Середовище стає однорідним безпосередньо в процесі стерилізації в автоклаві. Якщо необхідно приготовлене середовище відразу розлити у пробірки, його попередньо перед стерилізацією розплавляють на водяній бані.

3. Приготувати тверде живильне середовище на основі пептонної води (додати агар-агар із розрахунку 2%).

4. Приготувати м’ясо-пептонний агар (МПА).

5. Приготувати середовища для актиноміцетів.

Натуральне середовище – вівсяний агар (г): Вівсяне борошно (чи пластівці) – 20; агар – 20-25; дистильована вода – 1000 мл; сліди солей FeSO₄ – 0,1; MnCl₂ – 0,1; ZnSO₄ – 0,1. Замість дистильованої води і солей можна використовувати водопровідну воду. Для готування середовища вівсяне борошно (чи пластівці) варять у 1 л води 20 хвилин, фільтрують і доводять об’єм до 1 л. Середовище застосовують для збереження й визначення культуральних, а також морфологічних ознак.

Синтетичне середовище – середовище Гаузе (г): крохмаль розчинний – 20; КNO₃-1,0; К₂НРО₄ – 0,5; MgSO₄·7H₂O – 0,5; NaCl – 0,5; FeSO₄ – сліди; рН 7,0-7,4; дистильована вода – 1000 мл.

6. Підготувати середовища до стерилізації.

7. Підготувати для стерилізації 4-5 пробірок із водогінною водою (9 мл) і колбу із 90 мл водогінної води.

8. Середовища й воду віддати на стерилізацію.

9. Одержати накопичувальні культури аеробних спороутворюючих бактерій.

а) Одержати культуру сінної палички (Bacillus subtilis).

Для одержання накопичувальної культури сінної палички помістити приблизно 1 –3 г сіна в колбу на 250 мл і залити 20–50 мл водопровідної води, що нагріта до 40-50С. Добавити пучку крейди і прокип’ятити впродовж 15-30 хвилин, поки середовище не набуде колір настою міцного чаю – із сіна екстрагуються речовини, які будуть живильним матеріалом для бактерій. Вегетативні клітини й спори більшості бактерій за цей час загинуть. Тільки спори деяких бактерій, у тому числі термостійкі спори Bacillus subtilis, залишаться життєздатними. Відвар розлити в стерильні пробірки, закрити їх ватними пробками та розмістити в термостат із температурою 25-30С.

Через дві доби на поверхні середовища розвивається білувата плівка Bacillus subtilis, яка через 3-4 доби стає сірувато-зеленою. Інші мікроорганізми в цих умовах проростають рідко та в невеликій кількості.

б) Одержати культуру картопляної палички (Bacillus subtilis var. mesentericus).

Промиті бульби картоплі, не очищаючи, нарізати кільцями. Поверхню їх натерти крейдою для нейтралізації середовища й помістити в чашки Петрі на подвійний шар фільтрувального паперу, змоченого дистильованою водою. Чашки с картопляним середовищем обробити текучою парою вподовж 10 хвилин і поставити в термостат із температурою 27-30С на 3-4 доби.

На поверхні шматочків картоплі з’являється щільна зморшкувата плівка культури картопляної палички. Забарвлення плівки може бути різним: білувато-сірим, рожевим, жовто-бурим, чорним, що залежить від різновидності культури, яка здебільшого розвивається.

10. Одержати накопичувальну культуру анаеробних спороносних бактерій.

Неочищену картоплю нарізають шматочками, які можуть легко увійти в пробірку, заповнюють стерильну пробірку на 1/3 об’єму, додають пучку крейди і заповнюють водою майже доверху. Пробірки ставлять на водяну баню з температурою 80С на 10-15 хв. Потім пробірки закривають пробками і переносять у термостат із температурою 25С. У цих умовах уже через 2-3 дні в рідині виявляють елективну культуру бактерій маслянокислого бродіння – Clostridium pasteurianum. Для переважного розвитку саме їх створюються анаеробні умови, безспорові форми знищуються попереднім нагріванням, добавка крейди нейтралізує кислоти, що утворюються, та сприяє розвитку бактерій.

11. Одержати накопичувальну культуру оцтовокислих бактерій (Acetobacter aceti) – аеробних безспорових бактерій.

У стерильну конічну колбу наливають тонкий шар пива (0,5-1,0 см). Товщина шару пива має значення для результату досліду, тому що для оцтовокислих бактерій треба створити аеробні умови. Колби закривають ватяними пробками і ставлять у термостат із температурою 30С на 5-7 діб.

12. Одержати накопичувальні культури молочнокислих бактерій.

Молочнокислі бактерії з морфологічних властивостей поділяються на молочнокислі палички і молочнокислі стрептококи.

а) Для одержання накопичувальної культури молочнокислих паличок (Lactobacterium plantarum) у стерильні пробірки із солодовим суслом (6-8 за Баллінгом) добавити 12-15% (об’ємних) етанолу 96%-ного і внести 1% розсолу капусти або огірків. Засіяні пробірки помістити в термостат із температурою 30С.

б) Для виділення молочнокислих стрептококів (Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris) свіже молоко наливають у стерильні пробірки і залишають при температурі 30С для розвитку бактерій. Для подальшого дослідження відбирають пробірки з молоком, в яких утворився згусток раніше, ніж в інших пробірках.

На наступному занятті переконатися в одержанні накопичувальних культур різноманітних мікроорганізмів.

Про одержання накопичувальної культури судять візуально із проявлення ознак росту мікроорганізмів: помутніння середовища, появлення плівки, осаду, пігменту, відділення газів, а також із мікроскопії прижиттєвих і фіксованих мікробіологічних препаратів.

На наступному занятті одержані результати оформити у вигляді таблиці 8.1.

Таблиця 8.1 – Характеристика накопичувальних культур

Накопичувальна культура	Умови культивуван-ня	Візуальні ознаки росту	Морфологічні особливості

Лабораторна робота № 7

Тема: Культивування мікроорганізмів. Техніка посіву. Виділення чистих культур.

Мета: Засвоїти способи вирощування мікроорганізмів на цих живильних середовищах. Засвоїти методи виділення чистих культур, техніку посіву культур бактерій на рідкі і тверді живильні середовища. Засвоїти техніку розливання живильних середовищ.

Матеріали та устаткування: накопичувальні культури (Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus, Streptococcus lactis, Clostridium butiricum, й ін.), зразки ґрунту, чисті культури (Micrococcus lisodeikticus., Streptomyces recifensis), стерильні живильні середовища (МПА, пептонний агар, СА, вівсяний агар, середовище Гаузе, картопляний агар та ін.), водяна баня, електроплитка, стерильні чашки Петрі, мікробіологічні пробірки, шпателі Дригальського, піпетки, скляні палички, бактеріологічні петлі, спирт етиловий, спиртівка.

Перенесення вирощеної культури м/о клітин з одного середовища у свіже стерильне живильне середовище називається пересіванням чи пасеруванням. Пасерування – традиційний метод збереження мікроорганізмів із дотриманням інтервалів, що залежать від того, як одержана накопичувальна культура, приступають до виділення чистої. Чиста культура може бути одержана з окремої колонії або з одної клітини. Основним методом виділення чистих культур є метод Коха. Принцип його полягає в одержанні чистої культури з ізольованої колонії, що розвилася з однієї клітини.

Виділення чистої культури виконують з отриманої накопичувальної культури. Чиста культура може бути одержана механічним роз'єднанням мікроорганізмів методами, що використовують їхні біологічні особливості.

Метод заснований на тому, що за умов нанесення м/о з посівного матеріалу на густе середовище окремі клітини будуть закріплюватися (імобілізуватися) у певній точці твердого середовища і, розмножуючись, давати потомство (клон), що представляє колонію чистої культури м/о.

Спочатку вирощують культуру з механічним відокремлюванням клітин м/о за посівом на густі живильні середовища в чашки Петрі. Таким чином одержують ізольовані колонії, припускаючи, що вони виросли з однієї клітини, і паралельно вивчають культуральні властивості.

Потім виконують виділення чистої культури з ізольованих колоній на скошений агар. Після цього ідентифікують мікроорганізми з різноманітних властивостей.

Внесення клітин мікроорганізмів у стерильне живильне середовище для одержання накопичувальної чи чистої культури називається посівом, чи інокуляцією.

Посів (і пересів) м/о проводять із дотриманням визначених правил стерильності – усі маніпуляції здійснюють біля полум'я пальника (у радіусі 15-20 см) за можливістю швидко, щоб не забруднювати культуру сторонніми м/о. Не рекомендується робити різкі рухи, ходити біля того, хто виконує посів м/о, тому що рух повітря збільшує ймовірність випадкового забруднення культури.

Спосіб посіву в середовище залежить від його консистенції, якості матеріалу, що засівається, і мети дослідження.

Перед посівом необхідно написати на пробірці, колбі чи чашці Петрі назву м/о і дату посіву.