анализы / Задача 1

Задача 1. Определите возможность превращения цистеина в глюкозу. Рассчитайте количество моль цистеина, необходимого для синтеза 1 моль глюкозы. Схема решения задачи: а) напишите реакцию дезаминирования цистеина; б) вспомните, что пируват является исходным субстратом для синтеза глюкозы по пути глюконеогенеза; в) так как пируват образуется при дезаминировании цистеина, последний может использоваться как донор атомов углерода в синтезе глюкозы; г) так как для синтеза 1 моль глюкозы необходимо затратить 2 моль пирувата, следовательно для синтеза 1 моль глюкозы потребуется 2 моль цистеина. Задача 2. Алкалоид кофеин, содержащийся в кофе, вызывает гипергликемию, гипераминоацидурию, оказывает возбуждающее действие. Объясните, почему введение кофеина приводит к возникновению перечисленных симптомов. Схема решения задачи: а) для решения задачи необходимо вспомнить, что кофеин является ингибитором фосфодиэстеразы цАМФ. цАМФ – повсеместно распространенный нуклеотид, образующийся из АТФ при участии фермента аденилатциклазы, играет ключевую роль в механизмах действия ряда гидрофильных гормонов; б) фосфодиэстераза – фермент, катализирующий превращение цАМФ, являющегося вторичным посредником гормона, в неактивный метаболит АМФ, что приводит к падению уровня цАМФ в клетке и разрывает цепь превращений, вызванных гормонами и другими химическими сигнальными молекулами; в) таким образом, внутриклеточный уровень цАМФ определяется активностью двух ферментов – аденилатциклазы и фосфодиэстеразы; АТФ цАМФ + Н₂О АМФ аденилатциклаза фосфодиэстераза г) к гормонам, стимулирующим функционирование аденилатциклазы и повышающим внутриклеточную концентрацию цАМФ, относится адреналин. Основными метаболическими эффектами адреналина являются: усиление гликогенолиза в печени и мышцах, подавление синтеза гликогена, активация мобилизации жиров в жировой ткани. Помимо этого адреналин действует на сердечно-сосудистую систему, повышая кровяное давление, увеличивая силу и частоту сердечных сокращений. В результате такого действия гормона наблюдается увеличение концентрации энергетических субстратов (глюкозы и свободных жирных кислот) в крови, увеличение артериального давления, состояние возбуждения; д) введение кофеина, блокирующего работу фосфодиэстеразы, приводит к длительному увеличению уровня цАМФ в клетке, т. е. пролонгируется действие адреналина, что и проявляется гипергликемией, гипераминоацидурией, повышением артериального давления. Задача 3. После тяжелой травмы больная не получала пищу в течение 3 дней. Больной был прописан постельный режим, и, боясь поправиться, она исключила из рациона жиры, но не смогла отказаться от избыточного употребления сладких блюд. В течение нескольких месяцев масса тела женщины увеличилась на 4 кг. Почему масса тела больной увеличилась? Схема решения задачи: а) вспомнить, что через 30-60 минут после употребления большого количества легко усваиваемых углеводов (сахарозы), содержащихся в сладких блюдах, наблюдается алиментарная гипергликемия, стимулирующая секрецию β-клетками островкового аппарата панкреатической железы гормона инсулина; б) под влиянием инсулина ускоряется транспорт глюкозы из крови в адипоциты. Повышение внутриклеточной концентрации глюкозы и активация ключевых ферментов дихотомического пути окисления глюкозы имеет следствием образование большого количества субстратов, необходимых для синтеза триглицеридов, - ацетил-КоА и глицерол-3-фосфата. Кроме того, в присутствии инсулина наблюдается стимуляция пентозофосфатного пути окисления глюкозы, что обеспечивает синтез жирных кислот из ацетил-КоА энергией в форме НАДФН+Н⁺. Однако биосинтез жирных кислот из углеводов в жировой ткани человека протекает с высокой скоростью только после предшествующего голодания. в) одновременно инсулин тормозит процесс липолиза, так как гормончувствительная тканевая липаза при этом находится в неактивном дефосфорилированном состоянии; г) таким образом, после трехдневного голодания, избыточное количество углеводов, употребляемых больной, превращается в жиры, что и приводит к увеличению массы тела. Этому также способствует ограничение подвижности пациентки, находящейся на постельном режиме. Задача 4. У пациента, не получавшего пищу в течение нескольких недель, развивается коматозное состояние. При биохимическом исследовании сыворотки крови была обнаружена гипогликемия, содержание гидроксимасляной и ацетоуксусной кислот оставалось на низком уровне. Каковы возможные причины этих явлений? Схема решения задачи: а) у пациента, длительно не получавшего пищу, обнаруживается снижение концентрации глюкозы в крови (гипогликемия), так как снижается скорость процессов, обеспечивающих доставку этого энергетического субстрата в кровь, а именно гликогенолиза (печень) вследствие истощения депо гликогена в гепатоцитах; б) при этом одновременно со снижением секреции инсулина отмечается усиленная продукция контринсулярных гормонов, в частности, глюкагона. Под влиянием этих гормонов происходит обмен субстратами между печенью, жировой тканью, мышцами и мозгом. Это необходимо для поддержания концентрации в крови глюкозы, обеспечивающей энергетическими субстратами мозг и эритроциты. В свою очередь, остальные клетки переходят на альтернативные источники энергии, в первую очередь жиры. Образующиеся при липолизе жирные кислоты поступают в печень в большом количестве, поэтому увеличивается скорость β-окисления и концентрация ацетил-КоА в гепатоцитах. Скорость реакций цикла трикарбоновых кислот Кребса в этих условиях снижена, так как оксалоацетат, необходимый для образования цитрата, используется в глюконеогенезе. В результате чего скорость образования ацетил-КоА превышает скорость его окисления в ЦТК. Ацетил-КоА накапливается в митохондриях печени и используется для синтеза кетоновых тел (ацетоацетата и β-гидроксибутирата); в) таким образом, длительное голодание всегда сопровождается гипогликемией и кетонемией. Однако в крови обследуемого одновременно с гипогликемией обнаруживается снижение концентрации кетоновых тел, что может являться следствием генетически обусловленного дефекта фермента, участвующего в образовании кетоновых тел - β-гидрокси-β-метилглутарил-КоА-лиазы; г) мозг и другие отделы нервной ткани в качестве источника энергии не могут использовать жирные кислоты, так как они не проницаемы для гематоэнцефалического барьера. Обеспечение энергией, необходимой для функционирования нервной ткани и мозга, происходит за счет окисления глюкозы и кетоновых тел, концентрация которых в крови больного заметно снижена. Это является следствием развития у больного коматозного состояния, наблюдаемого при длительном голодании. Для выведения больного из состояния комы рекомендуется внутривенное введение раствора глюкозы. Задача 5. У больного обнаружена опухоль надпочечников, продуцирующая большое количество кортизола. Какие изменения биохимических показателей крови наблюдаются при этом? Каковы клинические признаки этой патологии? Схема решения задачи: а) для решения задачи необходимо вспомнить, что кортизол, синтезируемый пучковой зоной коркового вещества надпочечников, относится к группе глюкокортикоидных гормонов. Основные метаболические эффекты кортизола сводятся к следующему: 1) повышению концентрации глюкозы в крови за счет усиления глюконеогенеза в печени и снижения ее утилизации периферическими тканями; 2) усилению катаболизма белков, особенно в мышечной ткани (образующиеся при этом аминокислоты выступают в качестве субстратов глюконеогенеза); 3) слабому минералкортикоидному действию (стимуляции реабсорбции ионов Na⁺ и воды, секреции К⁺); б) секреция кортизола регулируется адренокортикотропином гипофиза по принципу отрицательной обратной связи: при высокой концентрации кортизола в сыворотке крови снижается секреция АКТГ гипофизом и наоборот; б) при аденоме коры надпочечников, увеличивается продукция кортизола, что приводит к гипергликемии, гипернатриемии, гипокалиемии, повышению в сыворотке крови содержания кортизола и снижению уровня АКТГ; г) клинические симптомы заболевания проявляются: 1) отеками и увеличением артериального давления, что обусловливается задержкой Na⁺ и воды; 2) мышечной слабостью, вызываемой гипокалиемией и усиленным катаболизмом белков мышц; 3) своеобразным перераспределением отложений жира (преимущественно в области шеи, лица, туловища), возникающим вследствие опосредованного инсулином усиления липогенеза; 4) ослаблением сопротивляемости организма инфекциям и ухудшением заживления ран вследствие интенсивной инволюции лимфоидной ткани и уменьшения образования антител. 9. Учебно-методическое и информационное обеспечение учебной дисциплины: а) основная литература 1. Березов Т.Т. Биологическая химия / Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин. – М.: Медицина, 2004. – 704 с. 2. Биохимия: учебник / Под ред. Е. С. Северина. – М.: ГЭОТАР–МЕД, 2004. – 784 с. 3. Николаев А.Я. Биологическая химия. М.: Медицинское информационное агентство, 2004. – 560 с. б) Дополнительная литература 272 с. Саранск: Изд-во Мордов. ун-та, 2010. 1. Основы биохимии: учеб. пособие: в 2 ч. Ч. 1 / Л.Я. Лабзина, Е.В. Громова, Э.В. Романова, Э.П. Санаева, Е.Н. Коваленко. 272 с. Саранск: Изд-во Мордов. ун-та, 2010.  Изд. 2-е, испр. и доп. 2. Основы биохимии: учеб. пособие: в 2 ч. Ч. 2 / Л.Я. Лабзина, Э.В. Романова, Э.П. Санаева, Е.Н. Коваленко. 3. Лабзина Л.Я. Руководство к практическим занятиям по биологической химии: учеб. пособие / Л.Я. Лабзина, Т.Ф. Атянина, Н.А. Липатова. – Саранск: Изд-во Мордов. ун-та, 2004. – 224 с. 4. Липатова Н.А. Гормоны. Регуляция обмена веществ и физиологических функций: учеб. пособие / Н.А. Липатова, Т.Ф. Атянина, М.В. Лабзина. – Саранск: Изд-во Мордов. ун-та, 2005. – 116 с. 5. Романова Э.В. Тестовые задания по обмену веществ / Э.В. Романова, Л.Я. Лабзина, Л.В. Зотова, Э.П. Санаева. – Саранск: Изд-во Мордов. ун-та, 2006. – 140 с. 6. Тесты по биохимии. Ч. 1: метод. указ. / Э.В. Романова, Е.Н. Коваленко, Э.П. Санаева, Л.Я. Лабзина. – Саранск: Изд-во «Вектор-Принт», 2009. – 64 с. 7. Тесты по биохимии. Ч. 1: метод. указ. / Э.В. Романова, Е.Н. Коваленко, Э.П. Санаева, Л.Я. Лабзина. – Саранск: Изд-во «Вектор-Принт», 2010. – 83 с. а) основная литература в) программное обеспечение и Интернет- ресурсы_________________________________ _____________________________________________________________________________ г) базы данных, информационно-справочные и поисковые системы___________________ ____________________________________________________________________________ 10. Материально-техническое обеспечение дисциплины: На кафедре имеется соответствующее оборудование для проведения занятий по биологической химии 1. Лабораторная посуда (пробирки, воронки, ступки с пестиками, колбы, стаканы, цилиндры, бюретки, чашки Петри, флаконы). 2. Спиртовки. 3. Термобани. 4. Термостаты. 5. Холодильник. 6. Вытяжные шкафы. 7. рН-метры. 8. Весы. 9. Фотоэлектроколориметр. 10. Дистиллятор. 11. Штативы. 12. Химические реактивы, диагностические тест-наборы, фармацевтические препараты. 13. Расходные материалы.

11. Методические рекомендации по организации изучения дисциплины:

ХИМИЯ И СВОЙСТВА ПРОСТЫХ БЕЛКОВ ЦВЕТНЫЕ РЕАКЦИИ НА БЕЛКИ И АМИНОКИСЛОТЫ -аминокислот, соединенных между собой пептидными связями. В составе белков обнаруживаются, в основном, 20 аминокислот, называемых протеиногенными. Одни и те же аминокислоты присутствуют в различных по структуре и функциям белках. Индивидуальность белковых молекул определяется порядком чередования аминокислот, т.е. их первичной структурой.По химической структуре белки представляют собой полимеры, состоящие из Присутствие белков в анализируемой жидкости (сыворотке, лимфе, ликворе и др.) может быть выявлено с помощью цветных реакций. Последние основаны на образовании окрашенных соединений в результате взаимодействия того или иного реактива с определенными группировками, входящими в состав молекулы белка. Все многообразие цветных реакций можно свести к двум основным типам: 1) универсальные цветные реакции, или реакции, характерные для всех белков, связанные с наличием во всех без исключения белках соответствующих функциональных групп или типов связей (биуретовая и нингидриновая реакции); 2) специфические реакции, характерные для отдельных аминокислот, входящих в состав молекулы белка, пептида или находящихся в свободном состоянии (ксантопротеиновая реакция, реакции Миллона, Адамкевича, Фоля и др.). Значение цветных реакций состоит в том, что они дают возможность установить белковую природу вещества и доказать присутствие некоторых аминокислот в составе различных природных белков. Последнее обстоятельство важно в установлении полноценности белков, которая, в свою очередь, определяется их качественным и количественным аминокислотным составом. Так, хорошо известно, что все протеиногенные аминокислоты можно классифицировать по степени заменимости для организма человека на 4 группы: 1) незаменимые (валин, лейцин, изолейцин, метионин, треонин, лизин, фенилаланин, триптофан); 2) условно заменимые (гистидин и аргинин); 3) частично заменимые (тирозин и цистеин); 4) заменимые (глицин, аланин, серин, пролин, глутамат, глутамин, аспартат, аспарагин). Отсутствие какой-либо незаменимой аминокислоты в белке (например, в белке желатине обнаруживается недостаточное количество или полное отсутствие ароматических и серусодержащих аминокислот) делает его молекулу неполноценной. Кроме того, на основании цветных реакций разработаны методы количественного определения белков и аминокислот, которые широко используются в биохимических лабораториях. Например, одним из широко применяемых в клинико-биохимических лабораториях методов оценки концентрации белка в сыворотке или плазме крови является метод, основанный на биуретовой реакции. Биуретовая реакция на пептидную связь Биуретовая реакция обусловлена наличием в белках пептидных связей (-СО-NH-), соединяющих остатки аминокислот. Она получила свое название от производного мочевины – биурета, который имеет две группировки -СО-NH- и образуется при нагревании сухой мочевины с отщеплением аммиака. Названную реакцию дают все без исключения белки, а также продукты их неполного гидролиза – пептоны и пептиды, имеющие не менее 2 пептидных связей. В щелочном растворе белка при добавлении разбавленного раствора сернокислой меди жидкость окрашивается в сине-фиолетовый или красно-фиолетовый цвет в зависимости от длины пептидной цепи. Реакция обусловлена присутствием в белке пептидных связей, которые образуют с ионами меди окрашенные солеобразные комплексные соединения. Интенсивность окраски комплекса зависит от концентрации белка и количества медной соли в растворе. Биуретовую реакцию дают также некоторые небелковые вещества, например биурет (NH₂-CO-NH-CO-NH₂), оксамид (NH₂-CO-CO-NH₂), мочевина (NH₂-CO-NH₂), ряд аминокислот (гистидин, серин, треонин, аспарагин). Ход работы. В одну пробирку наливают 5-10 капель 1% раствора яичного белка, а в другую – 5-10 капель 1% раствора желатина. В каждую пробирку добавляют по 10 капель 10% раствора NaOH и по 1 капле 1% раствора CuSO₄. Наблюдается устойчивое сине-фиолетовое окрашивание. -аминокислотыНингидриновая реакция на -аминокислот при нагревании с нингидрином дают синее или фиолетовое окрашивание. Указанная реакция используется для качественного и количественного определения аминокислот в аминокислотных анализаторах.-аминокислот в молекуле белка. Растворы белка, пептидов и -положении, и обусловлена наличием Нингидриновая реакция характерна для аминогрупп, находящихся в -аминогруппы, не вступают в реакцию с нингидрином.-аминогруппа ацетилирована. Следовательно, циклопептиды и МСГ, не имеющие в своем составе свободной -аминогруппа может быть модифицирована. Так, меланоцитстимулирующий гормон (МСГ) гипофиза человека является пептидом, в котором -карбоксигруппой С-концевой аминокислоты. К ним относят антимикробный агент широкого спектра действия грамицидин S и иммунодепрессант циклоспорин. Кроме того, в некоторых пептидах -аминогруппа N-концевой аминокислоты образует пептидную связь с Следует иметь в виду, что некоторые пептидные антибиотики, синтезируемые микроорганизмами, являются циклопептидами, в которых -аминокислота подвергается окислительному дезаминированию (отщеплению NHХимизм нингидриновой реакции следующий: при взаимодействии с нингидрином ₂-группы) и декарбоксилированию (отщеплению СО₂) с образованием альдегида. Нингидрин при этом восстанавливается и связывается со второй молекулой нингидрина посредством молекулы аммиака, образуя продукты конденсации (комплекс Руэмана), окрашенные в синий, фиолетовый, красный или желтый (в случае пролина) цвет. Ход работы. В две пробирки наливают по 0,5 мл растворов яичного альбумина и желатина. Затем в обе пробирки приливают по 2-3 капли 0,1% раствора нингидрина и нагревают. При этом наблюдается розово-фиолетовое окрашивание, постепенно переходящее в синее. Со временем интенсивность окраски увеличивается. Ксантопротеиновая реакция на циклические аминокислоты Ксантопротеиновая реакция обнаруживает в белках присутствие циклических аминокислот (фенилаланина, тирозина и триптофана), содержащих в своем составе бензольное кольцо. Названную реакцию дают почти все белки, за исключением клупеина, сальмина, желатина, в молекулах которых почти полностью отсутствуют ароматические аминокислоты. Ксантопротеиновая реакция основана на образовании нитропроизводных этих аминокислот. Эта реакция обусловлена нитрованием бензольного кольца ароматических аминокислот с образованием динитросоединений желтого цвета, которые в щелочной среде превращаются в хиноидные формы аммонийных или натриевых солей, окрашенных в оранжевый цвет. Ход работы. В две пробирки наливают по 5-10 капель растворов: в первую – яичного альбумина, во вторую – желатина, добавляют по 3-5 капель концентрированной азотной кислоты и нагревают. В одной из пробирок образуется белый осадок, который при нагревании окрашивается в желтый цвет и постепенно растворяется (происходит гидролиз белка), придавая желтую окраску раствору. Пробирки охлаждают, к полученному раствору осторожно добавляют 8-10 капель концентрированного раствора аммиака или 30% раствора едкого натра и наблюдают за изменением его окраски. В пробирке с яичным белком желтая окраска осадка переходит в оранжевую. Образование желтых пятен на коже при попадании азотной кислоты обусловлено этой реакцией. Реакция Миллона на тирозин Реакция Миллона обусловлена наличием в белках аминокислоты тирозина. Реактив Миллона, представляющий собой раствор азотнокислых солей окиси и закиси ртути в азотной и азотистой кислотах, дает окрашивание почти со всеми фенолами. Ее химизм заключается в реакции нитрования фенольного ядра в молекуле тирозина с последующим образованием ртутной соли динитротирозина, окрашенной в розовый цвет. При нагревании или продолжительном стоянии раствора белка с реактивом Миллона образуется осадок, окрашенный сначала в розовый, а затем в кирпично-красный цвет. Ход работы. В две пробирки наливают по 5-10 капель раствора исследуемого белка (яичного белка и желатина), добавляют по 2-3 капли реактива Миллона и медленно нагревают. Осадок яичного белка окрашивается в кирпично-красный цвет. В пробе с желатиной осадок растворяется, и жидкость остается бесцветной. Реакция Адамкевича на триптофан Реакция обусловлена наличием в молекуле белка остатка триптофана, который реагирует с глиоксиловой кислотой (присутствующей в виде примесей в концентрированной уксусной кислоте) с образованием окрашенного в красный цвет продукта конденсации. Концентрированная серная кислота принимает участие в реакции в качестве водоотнимающего средства. Ход работы. В две пробирки, содержащие по 5-10 капель растворов яичного белка и желатина, добавляют по 1 мл ледяной уксусной кислоты, слегка нагревают до растворения белка и после охлаждения, осторожно наклонив пробирку, подслаивают 1 мл концентрированной серной кислоты так, чтобы жидкости не смешивались. При стоянии с раствором яичного белка на границе двух слоев жидкости появляется красно-фиолетовое кольцо. В пробирке с раствором желатина реакция отрицательная, поскольку этот белок не содержит триптофана. Реакция Сакагучи на аргинин -нафтолом, образует продукт конденсации розово-красного цвета.Реакция открывает присутствие в белке аминокислоты аргинина, имеющей в своем составе гуанидиновую группировку. При этом следует отметить, что реакция Сакагучи, также как и многие другие цветные реакции, не является строго специфичной для аргинина. Ее дают и другие производные гуанидина – метилгуанидин, гликоциамин, но эти вещества отсутствуют в молекулах белков. Реакция обусловлена тем, что в щелочной среде в присутствии гипобромида натрия гуанидиновая группировка окисляется и, соединяясь с Ход работы. -нафтола и 2-3 капли раствора гипобромида натрия. Наблюдают появление розового окрашивания, интенсивность которого постепенно усиливается.В две пробирки с 5-10 каплями исследуемых белков приливают эквивалентное количество 10% раствора едкого натра, 3 капли 0,1% спиртового раствора Реакция Фоля на цистеин и цистин Реакция Фоля указывает на присутствие в белке аминокислот – цистеина и цистина, содержащих слабосвязанную серу. Метионин, хотя и является серусодержащей аминокислотой, не дает названной реакции, так как сера в нем связана прочно. Реакция заключается в том, что при кипячении белка со щелочью цистеин легко отщепляет серу в виде сернистого натрия, дающего с плюмбитом натрия черный или бурый осадок сернистого свинца. Ход работы. В две пробирки, содержашие по 5 капель растворов яичного белка и желатина, приливают по 5 капель 30% раствора едкого натра и 1 капле 5% раствора ацетата свинца. При интенсивном кипячении жидкость в пробирке с яичным белком темнеет, так как образуется черный осадок сульфида свинца. В пробирке с желатином черного осадка не появляется, так как желатин почти не содержит серусодержащих аминокислот. Результаты проведенных опытов рекомендуется записать в форме таблицы:

Наименование реакции	Исследуемый материал	Реактивы, условия проведения реакции	Наблюдаемое окрашивание (осадок)	Чем обусловлена реакция
1	2	3	4	5

Контрольные вопросы

1. Какие соединения являются структурными компонентами белковых молекул? Каким образом связаны между собой эти структурные компоненты в белках?

2. Какова роль белков в жизнедеятельности организма?

3. Чем обусловлены цветные реакции на белки?

4. Для каких целей в биохимии используются цветные реакции на белки?

5. Какие цветные реакции можно использовать для качественного и количественного обнаружения белков в различных биологических жидкостях?

6. Наличие каких группировок в структуре белка открывается биуретовой реакцией? Будет ли данная реакция положительна с раствором, содержащим смесь аминокислот: тирозин, глицин, валин и цистеин?

7. Наличием каких группировок в структуре исследуемого соединения обусловлена ксантопротеиновая реакция? Можно ли использовать эту реакцию для определения суммарного количества ароматических аминокислот в сыворотке крови?

8. Напишите формулы аминокислот, имеющих в своем составе бензольное кольцо. С помощью каких реакций можно обнаружить их присутствие в реакционной смеси?

9. Напишите формулы серусодержащих аминокислот. Какой качественной реакцией можно обнаружить присутствие тиоловых групп в молекулах предложенных аминокислот? Все ли серусодержащие аминокислоты можно обнаружить данной реакцией?

10. Напишите формулу аминокислоты, имеющей в своем составе гуанидиновую группу. Какой качественной реакцией можно открыть присутствие гуанидиновой группы в структуре этой аминокислоты?

11. Напишите формулы тетрапептида три-цис-арг-тир и циклотетрапептида, состоящего из этих аминокислот. Какие цветные реакции будут положительны с указанными тетрапептидами? С помощью какой цветной реакции можно обнаружить различия в их структуре?

12. Какой из двух исследуемых Вами белков (яичный альбумин или желатин) является полноценным? Почему?

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ АМИНОКИСЛОТ Хроматографические методы применяют для сорбционно-динамического разделения смеси аминокислот и других веществ. В зависимости от природы сорбента хроматография подразделяется на адсорбционную, распределительную, ионообменную, гельхроматографию и биоспецифическую (аффинную). Для разделения смеси аминокислот в настоящее время широко используется метод распределительной хроматографии на фильтровальной бумаге, который представляет одну из модификаций метода хроматографического анализа, предложенного русским ученым М.С. Цветом в 1903 г. Известно, что в основу одной из предложенных классификаций аминокислот положено различие в полярности (а следовательно, растворимости в воде) их радикалов. При этом аминокислоты делят на: 1) неполярные или гидрофобные (аланин, валин, лейцин, изолейцин, метионин, фенилаланин, пролин, фенилаланин, триптофан); 2) полярные (гидрофильные) незаряженные (глицин, серин, треонин, тирозин, аспарагин и глутамин); 3) полярные отрицательно заряженные (аспартат, глутамат); 4) полярные положительно заряженные (лизин, аргинин, гистидин). Для проведения распределительной хроматографии необходима система, состоящая из неподвижной фазы (носителя – хроматографической фильтровальной бумаги) и подвижной фазы (растворителя). На неподвижную фазу наносится смесь разделяемых веществ (аминокислот), и через нее пропускается растворитель, насыщенный водой. Чем лучше данное вещество растворимо в подвижной фазе, тем дальше оно продвигается по направлению тока растворителя по неподвижной фазе. Менее растворимые в органическом растворителе вещества распределяются ближе к точке нанесения (соответственно своей растворимости). Положение отдельных аминокислот на фильтровальной бумаге обнаруживают при помощи цветной реакции с нингидрином. Ряд аминокислот дает при этом различную окраску: голубую, синюю, фиолетовую, желтую или бурую. Скорость перемещения отдельных аминокислот на хроматограмме выражают величиной Rf. Коэффициент распределения Rf определяется как отношение расстояния, пройденного аминокислотой от места нанесения аминокислоты до середины пятна (a), к расстоянию, пройденному фронтом растворителя от места нанесения аминокислоты (b): Rf = а/b. Rf является характерной величиной для каждой аминокислоты и постоянен при данных условиях опыта (температура, растворитель, сорт бумаги). Идентифицируют аминокислоты на хроматограммах путем нанесения на последние «свидетелей» - растворов отдельных аминокислот. Существуют различные способы хроматографического разделения смеси аминокислот. В зависимости от направления движения органического растворителя различают восходящую, нисходящую, радиальную, одномерную и двумерную хроматографии. Для количественного определения аминокислот в исследуемой жидкости (сыворотка крови, моча, ликвор, гидролизат белка) пятна на хроматограмме вырезают, подвергают элюированию в спиртовом растворе сульфата меди и колориметрированию. Хроматографическое определение аминокислот на бумаге. Радиальная хроматография Разделение смеси аминокислот можно производить, применяя метод радиальной хроматографии. Распределение аминокислот при этом основано на их различной растворимости в двух малосмешивающихся жидкостях. При этом методе используется хроматографическая фильтровальная бумага. В качестве камеры для хроматографии можно использовать чашки Петри с одинаковым диаметром основания чашки и крышки. Ход работы. Из хроматографической бумаги вырезают диск диаметром 14 см, простым карандашом проводят две перпендикулярные линии, пересекающиеся в центре диска и, таким образом разделяют его на 4 равных сектора. Из точки пересечения диагоналей строят окружность с радиусом 10 мм, которая будет являться линией старта. У основания каждого сектора карандашом отмечается, какой «свидетель» или смесь будет наноситься в данном секторе (например, ала, тир, лей, смесь). Диск хроматографической бумаги кладут на чашку Петри так, чтобы он опирался на ее края. В центре каждого сектора (на окружности) ставится точка, в которую с помощью тонкого капилляра наносятся испытуемая смесь аминокислот и аминокислоты-«свидетели»: аланин, тирозин, лейцин, после чего бумагу просушивают на воздухе. Из небольшого треугольника фильтровальной бумаги делают фитилек и вставляют его в отверстие, проделанное толстой иглой в центре хроматограммы. Нижний конец фитилька должен касаться дна чашки, в которую наливают растворитель, состоящий из смеси n–бутилового спирта, уксусной кислоты и воды в соотношении 15:15:10 в количестве 10 -15 мл. С 10 минут; при этом проявляются отдельные аминокислоты в виде синих и фиолетовых пятен.С 10-14 минут (до исчезновения запаха растворителя). Высушенную хроматограмму проявляют, опрыскивая из пульверизатора 0,2% ацетоновым раствором нингидрина. Затем ее вновь сушат при 105Хроматограмму плотно прикрывают крышкой. По фитилю растворитель будет подниматься вверх и распределяться по окружности. Хроматограмму снимают, когда фронт растворителя дойдет до краев чашки Петри, отмечают его простым карандашом и сушат в сушильном шкафу при 105 Для каждой из нанесенных аминокислот-свидетелей и каждого пятна смеси рассчитывается Rf следующим образом: измеряется расстояние от места нанесения раствора аминокислоты до середины проявленного пятна (расстояние а) и расстояние от места нанесения раствора аминокислоты до фронта растворителя (расстояние b). Сравнивая Rf, рассчитанные для пятен смеси и Rf «свидетелей», делается вывод о том, какие аминокислоты присутствуют в анализируемой смеси. Разделение смеси аминокислот методом распределительной хроматографии имеет важное значение для установления первичной структуры белковой молекулы. Кроме того, определение свободных аминокислот важно для изучения интенсивности обмена белков в организме. Содержание аминокислот в сыворотке крови и моче здорового человека достаточно постоянно, однако уровень их может изменяться при ряде заболеваний. Увеличение содержания аминокислот в сыворотке крови отмечается при тяжелых поражениях печени (печеночная кома, острая атрофия), отравлениях гепатотропными ядами, острой и хронической почечной недостаточности, сахарном диабете с кетоацидозом, тяжелом шоке. Снижение уровня аминного азота в сыворотке наблюдается при гиперфункции коры надпочечников, нефротическом синдроме, лихорадке. Гипераминоацидурия (повышение выделения аминокислот с мочой) встречается при заболеваниях паренхимы печени, что связано с нарушением процессов катаболизма аминокислот, а также с усиленным распадом клеток. Концентрация аминокислот в моче повышается также при тяжелых инфекционных заболеваниях, злокачественных новообразованиях, тяжелых травмах гипертиреозе, коматозных состояниях. Известны патологические состояния, в основе которых лежит нарушение метаболизма отдельных аминокислот. Многие из этих заболеваний имеют врожденный или наследственный характер. Например, при фенилкетонурии в крови и моче больных резко возрастает уровень фенилаланина и некоторых его производных (фенилпировиноградной, фенилмолочной и фенилуксусной кислот); концентрация тирозина увеличивается в крови больных с тирозинозом; цистинурия сопровождается повышенной экскрецией цистеина, лизина, аргинина и орнитина с мочой. Контрольные вопросы