Оформление лабораторной тетради.

Зарисовать колонии клубеньковых бактерий с демонстрационного препарата.

Занятие № 16 Тема: вирусы. Особенности строения и жизнедеятельности. Взаимодействие вируса и клетки. Культивирование вирусов.

Цель занятия: познакомиться с организацией и оборудованием вирусологической лаборатории, изучить природу и происхождение вирусов, их отличия от бактерий, освоить методы культивирования вирусов и методы обнаружения вирусов в культуре клеток.

План занятия.

1. Организация и оборудование вирусологической лаборатории.

2. Общая характеристика вирусов, их место в биосфере.

3. Основные критерии современной классификации вирусов.

4. Структурные компоненты вириона.

5. Химический состав вирусов.

6. Репродукция вирусов. Стадии взаимодействия вируса с клеткой хозяина.

7. Методы культивирования вирусов: а) в организме восприимчивого животного; б) в курином эмбрионе; в) в культуре клеток (тканевые культуры).

8. Характеристика и классификация тканевых культур.

9. Методы обнаружения вируса в культуре клеток: а) цитопатический эффект; б) цветная проба; в) метод бляшек; реакция гемадсорбции; г) реакция гемагглютинации (РГА).

Задания для выполнения лабораторной работы.

1. Провести заражение куриных эмбрионов вируссодержащим исследуемым материалом.

Подготовка яиц.На скорлупе яиц с живыми эмбрионами, которые различают по красному цвету кровеносных сосудов и движению эмбриона (при овоскопии), карандашом отмечают место заражения. Скорлупу перед заражением обрабатывают 70% спиртом, обжигают на пламени, а затем дезинфицируют 2% раствором йода.

Существуют следующие способы заражения: в аллантоисную полость, в полость амниона, в желточный мешок.

Заражение в аллантоисную полость. Специальным стилетом прокалывают скорлупу сбоку и над воздушной камерой, после чего шприцем вводят 0,1-0,2 мл вируссодержащего материала на глубину 2-3 мм ниже границы воздушной камеры. Оба прокола в скорлупу заливают расплавленным стерильным парафином. В зависимости от типа вируса инкубируют 48-72 ч.

Заражение в полость амниона.Скорлупу над воздушной камерой разрезают ножницами и через образовавшееся окно радиусом 1-1,5 см осторожно отслаивают глазным пинцетом подскорлупную оболочку. Через обнажившийся участок хорион-аллантоисной оболочки делают прокол глазным пинцетом и продвигают его к эмбриону. Затем пинцетом захватывают амниотическую оболочку и осторожно вытягивают часть наружу через образовавшееся отверстие в хорион-аллантоисной оболочке. Извлеченный эмбрион перехватывают широким пинцетом, который держат в левой руке. Затем шприцем с иглой вводят в вытянутый амниотический мешок 0,1-0,2 мл исследуемого материала. После заражения пинцет разжимают и амнион погружается в аллантоисную полость. Окно в скорлупе закрывают стеклянным колпачком, края которого заливают стериальным парафином. Яйцо помещают в штатив тупым концом вверх.

Заражение в желточный мешок.Скорлупу прокалывают по центру воздушной камеры и через образовавшееся отверстие при помощи туберкулинового шприца с иглой № 21 длиной 3,8 см вводят 0,2-0,5 мл испытуемого материала в желточный мешок. Для этого иглу вводят вертикально до упора. Затем ее быстро вынимают и отверстие заливают парафином. Яйца в вертикальном положении инкубируют 48 ч при 37˚С.

2. Изучить цитопатическое действие (ЦПД) вируса на клеточные культуры по демонстрационным микропрепаратам, таблицам.

3. Провести реакцию гемагглютинации (РГА) и учесть результат.

Реакция гемагглютинации (РГА) широко применяется в вирусологии для обнаружения вирусов и их титра в исследуемом материале. РГА осуществляется на плексигласовых пластинах с лунками, в которых готовят двукратные разведения вируссодержащего материала. Затем добавляют взвесь эритроцитов и инкубируют 30 мин при комнатной температуре.

Таблица 13

Схема постановки РГА

Ингредиенты, мл	Номер лунки, разведения
	1	2	3	4	5	6
	1:10	1:20	1:40	1:80	1:160	контроль
Физиологический раствор	- 0,5	0,5 0,5	0,5 0,5	0,5 0,5	0,5 0,5	0,5 0,5 вылить в дез. р-р
Вируссодержащий материал
1% взвесь эритроцитов	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
Инкубация 30 мин при комнатной температуре
Результат

При геммагглютинации осадок имеет форму зонтика и занимает все дно лунки. При отсутствии феномена эритроциты оседают в центре лунки в виде компактного диска.