1. Ферменты, или энзимы, представляют собой высокоспециализированный класс веществ белковой природы, используемый живыми организмами для осуществления с высокой скоростью многих тысяч взаимосвязанных химических реакций, включая синтез, распад и взаимопревращение огромного множества разнообразных химических соединений.

Первые данные, указывающие на то, что в живых клетках содержатся вещества, катализирующие определённые реакции, были получены в 1897г. немецким учёным Э.Бухнером. В 1814г. К.С. Кирхгоф впервые получил препарат фермента (в виде раствора), вызывающего превращение крахмала в более простые сахара.

В 30-х годах XX в. некоторые ферменты были получены в кристаллическом состоянии. Так, в 1926 г. Самнер сообщил о выделении из бобов фермента уреазы, предположительно имеющего белковую природу. Однако отнесение уреазы к белкам сочли вначале нелепым. Последующие исследования Самнера и независимо Нортропа и Стенли привели к выделению ещё нескольких ферментов, и, наконец, в 1935 г. белковая природа ферментов стала общепризнанной. Большое значение этого открытия, в частности, отражено в факте присуждения Нобелевской премии в1946 г. Самнеру, Нортропу и Стенли.

Дальнейшие исследования подтвердили, что по химической природе ферменты являются белками.

КРАТКАЯ ИСТОРИЯ РАЗВИТИЯ УЧЕНИЯ О ФЕРМЕНТАХ

Несмотря на то, что явления брожения и переваривания известны с незапамятных времен, зарождение учения о ферментах (энзимология) относится к первой половине XIX века. Первое научное представление о ферментах было дано в 1814 г. петербургским ученым К. С. Кирхгофом, который показал, что не только проросшие зерна ячменя, но и экстракты из солода способны осахаривать крахмал с превращением его в мальтозу. Вещество, извлекаемое из проросшего ячменя и обладающее способностью превращать крахмал в мальтозу, получило название амилазы. Либих и Велер открыли другой агент, расщепляющий амигдалин, содержащийся в эфирном масле горького миндаля. Действующий агент, содержащийся в миндале, был назван эмульсином. В последующие годы были описаны другие ферменты, в частности, пепсин и трипсин, вызывающие гидролиз белков в желудочно-кишечном тракте.

Наибольшее внимание исследователей привлекали процессы окисления в организме. Уже был известен феномен химического катализа, означающий, что и многие реакции in vitro протекают быстро и энергично в присутствии ничтожных количеств примесей, как будто не участвующих в реакции. В частности, была установлена высокая каталитическая роль ряда неорганических веществ. Горение сахара на воздухе, например, происходит очень медленно, если же добавить немного солей лития (или золы, также содержащей ничтожные количества лития), то горение сахара идет весьма интенсивно в соответствии со следующим уравнением:

С₆Н₁₂О₆ + 60₂ --> 6СO₂ + 6Н₂0

Как известно теперь, в живых организмах "горение" (а точнее окисление) углеводов также протекает быстро и до тех же конечных продуктов обмена, т. е. СO₂ и Н₂O с выделением (и накоплением) энергии. Однако это "горение" происходит при относительно низкой температуре, без пламени и, что особенно интересно, в присутствии воды. Разумеется, в этих необычных условиях без действия ферментов, получивших наименование биологических катализаторов, не было бы окисления сахаров. Забегая несколько вперед, укажем, что в процессе превращения (окисления) глюкозы в организме до СО₂ и Н₂O участвует последовательно около 15 различных ферментов (см. Обмен углеводов).

Биологические катализаторы, т. е. ферменты, как оказалось, не вызывают, в отличие от неорганических катализаторов, каких-либо других (побочных) реакций, и не осуществляют реакций, невозможных по термодинамическим условиям, но и те, и другие катализаторы только ускоряют химические реакции, обычно протекающие очень медленно. В качестве примера можно привести одну и ту же химическую реакцию, на которую действует и фермент, и неорганический катализатор. Так, перекись водорода может медленно расщепляться на молекулярный кислород и воду и в отсутствие катализатора, но в присутствии мелкораздробленной платины эта реакция протекает с высокой скоростью:

Эту же реакцию можно провести, и притом еще намного быстрее, в присутствии фермента каталазы, содержащейся, в частности, в эритроцитах, причем образуются те же конечные продукты распада перекиси водорода. Аналогично ионы меди и особый фермент аскорбатоксидаза интенсивно катализируют окисление аскорбиновой кислоты (витамин С) молекулярным кислородом в дегидроаскорбиновую кислоту (см. ниже).

Таким образом, можно считать установленным, что ферменты катализируют ряд химических реакций, аналогичных химическим реакциям, катализирующимся неорганическими веществами.

Ферменты долгое время подразделяли на "организованные" и "неорганизованные" в зависимости от того, удавалось или не удавалось осуществить изучаемую химическую реакцию in vitro в отсутствие живых клеток. В частности, связана ли химическая реакция с жизнедеятельностью клеток микроорганизмов? Дискуссия велась, главным образом, вокруг вопроса о сущности дрожжевого брожения и вызвала знаменитую полемику между Л. Пастером и Ю. Либихом.

Пастер опубликовал серию работ, где показал, что спиртовое брожение осуществляется цельными, неповрежденными дрожжевыми клетками. По его мнению, процесс брожения обусловлен размножением дрожжевых клеток, т. е. их жизнедеятельностью; отсюда и их название "организованные" ферменты, ферменты живой клетки, ферменты "существа". После нагревания дрожжевые клетки теряли свою способности сбраживать сахар. Пастер, однако, не отрицал существования и "неорганизованных" ферментов, т. е. ферментов "веществ", в частности амилазы, эмульсина, пепсина и др. Подобное противопоставление ферментов "существ" и "веществ" имело явно виталистический характер и напоминало противопоставление живой и неживой природы. Либих, будучи химиком, напротив, считал, что "организованных" ферментов вообще не существует и что спиртовое брожение и сходные процессы обусловлены действием химических веществ, которые могут быть выделены из дрожжевой клетки или любого другого объекта живой природы. Однако Либиху не удалось выделить эти вещества, и спор не был разрешен.

Только в 1871 г. М. М. Манассеина впервые показала, что дрожжи и после разрушения клеточной структуры (растертые с измельченным песком), когда фактически они лишены жизненных функций, способны сбраживать сахар. Работы Бухнера (1897) окончательно решили спор в пользу Либиха. Бухнер приготовил бесклеточный дрожжевой сок, полученный прессованием клеток под высоким давлением (до 500 ат), и, поскольку этот сок легко разлагался при хранении бактериями из воздуха, он в качестве консерванта добавлял сахар (эта функция сахара была известна при приготовлении джемов). К своему удивлению, он обнаружил, что бесклеточный сок из дрожжей сбраживал сахар с образованием спирта; таким образом, Бухнер показал, что присутствие живых организмов не обязательно для процесса брожения. Фермент брожения получил название зимазы (от греч. zyme — дрожжи). В лаборатории А. Н. Лебедева зимаза была получена более простым способом: настаиванием в теплой воде высушенных дрожжевых клеток.

Таким образом, благодаря исследованиям Бухнера и А. Н. Лебедева было положено начало детальному изучению процесса анаэробного окислительно-восстановительного расщепления углеводов, который вскоре был полностью расшифрован (см. Гликолиз). Эти же работы окончательно опровергли виталистические представления о сущности процесса брожения. В настоящее время считается установленным, что любую из протекающих в живых организмах (или клетках) химическую реакцию можно в принципе осуществить вне организма (или клетки), если экспериментатору удается выделить соответствующий фермент (или систему ферментов), катализирующий данную реакцию, и создать оптимальные условия для его действия¹.

2. Ферменты, понятие, сходства и отличия ферментов и неорганических катализаторов

Термин «фермент» произошел от лат. «fermentum» — закваска. В англоязычной литературе употребляется термин «энзим» от греч. «enzyme» – в закваске. Это отражает участие ферментов в брожении УГВ.

Ферменты – это специализированные белки, образуются в клетках и способны ускорять биохимические процессы, т.е. это биологические катализаторы.

Многие ферменты для проявления каталитической активности нуждаются в присутствии некоторых веществ небелковой природы – кофакторов. Различают 2 группы кофакторов – ионы металлов (а также некоторые неорганические соединения) и коферменты, которые представляют собой органические вещества. В числе коферментов есть такие, которые содержат металлы (железо в геме, кобальт в кобаламиде).

Фермент, содержащий кофермент, называется холофермент, его белковая часть называется апофермент (двухкомпонентные, или сложные ферменты). Кроме этого различают простые (однокомпонентые ферменты) – состоят только из белковой части.

Сходства ферментов и неорганических катализаторов:

1. катализируют только энергетически возможные реакции;

2. не изменяют равновесия в обратимых реакциях;

3. не изменяют направление реакции;

4. не расходуются в результате реакции.

Отличия между ферментами и неорганическими катализаторами (общие свойства ферментов):

1. сложность строения;

2. высокая мощность действия. За единицу фермента принимают такое его количество, которое катализирует превращение 1мкМ вещества за 1 минуту;

3. специфичность;

4. это вещества с регулируемой активностью;

5. действуют в мягких условиях организма.

Опыт № 1. Обнаружение действия ферментов

· Получите ферментативный препарат амилазы слюны (ополоскать рот водой, затем набирать 10-20 мл дистиллированной воды, выдержать во рту 2-3 мин и полученный раствор амилазы слить в стакан);

· В две пробирки налейте по 10 капель раствора крахмала, подпишите пробирки контрольиопыт;

· В контрольную пробирку налейте 5 капель воды, в опытную – 5 капель амилазы слюны;

· Перемешайте и поставьте в термостат при 37⁰С на 15 мин;

· Затем опытную пробирку разделите пополам, отливая половину содержимого в чистую пробирку;

· В одну пробирку добавьте 1 каплю йода, в другую добавьте 1 каплю сульфата меди и 4 капли гидрооксида меди и нагрейте до кипения (реакция Троммера);

· Аналогичные реакции проведите с контрольной пробиркой;

· Отметьте изменение окраски и данные занесите в таблицу.

3. Химическая природа ферментов

Доказательства белковой природы ферментов:

1. Ферменты при гидролизе распадаются на аминокислоты.

2. Под действием кипячения и др. факторов ферменты подвергаются денатурации и теряют каталитическую активность.

3. Осуществлено выделение ферментов в форме кристаллов белка.

4. Ферменты оказывают высокоспецифическое действие.

Прямым доказательством белковой природы ферментов является лабораторный синтез первого фермента – рибонуклеазы.

Выделяют простые ферменты, состоящие только из полипептидной цепи: пепсин, трипсин, уреаза, рибонуклеаза, фосфатаза и др.

Большинство природных ферментов - сложные белки. Их небелковые компоненты называются кофакторами и необходимы для выполнения ферментом его каталитической роли. Кофакторами ферментов являются витамины или соединения, построенные с их участием (коэнзим А, НАД⁺, ФАД); фосфорные эфиры некоторых моносахаридов, ионы металов.

Кофермент - небелковый фактор, который легко отделяется от белковой части - апофермента при диссоциации.

Простетическая группа – ковалентно связанный с белковой цепью небелковый компонент, который не отделяется при выделении и очистке фермента.

Весь фермент вместе с простетической группой назыывают холоферментом. Только объединение апофермента и кофермента обеспечивает активность холофермента.

Субстрат – вещество, подвергающееся превращениям под действием фермента.

Активный центр - специфический участок на поверхности фермента, связывающийся с молекулой субстрата и непосредственно участвующий в катализе. Активные центры ферментов образуются на уровне третичной структуры. У сложных ферментов в состав активного центра входят также простетические группы. Кофакторы ферментов выполняют роль промежуточных переносчиков атомов или групп.

В активном центре различают два участка. Субстратный (связывающий) центр - участок, отвечающий за присоединение субстрата. Его называют контактной, или «якорной» площадкой фермента. Каталитический центр отвечает за химическое превращение субстрата. В состав каталитического центра большинства ферментов входят такие аминокислоты, как серин, цистеин, гистидин, тирозин, лизин. Субстратный центр может совпадать (или перекрываться) с каталитическим центром.

Аллостерический центр - участок молекулы фермента вне его активного центра, который способен связываться с тем или иным веществом (лигандом). В результате изменяется третичная, а часто и четвертичная структура белковой молекулы. Как следствие изменяется конфигурация активного центра и каталитическая активность фермента. Это т. н. аллостерическая регуляция активности ферментов. Ферменты, активность каталитического центра которых подвергается изменению под влиянием аллостерических эффекторов, называют аллостерическими.

Некоторые из ферментов являются полифункциональными, т. е. обладают несколькими энзиматическими активностями, но всего лишь одной полипептидной цепью. Их белковая цепь образует несколько доменов, каждый из которых характеризуется своей каталитической активностью. Например, алкогольдегидрогеназа не только катализирует реакцию окисления спиртов, но также реакции обезвреживания ряда ксенобиотиков.

Изоферменты - это множественные формы фермента, катализирующие одну и ту же реакцию, но отличающиеся друг от друга по физическим и химическим свойствам - сродству к субстрату, активности, электрофоретической подвижности.

Например, фермент лактатдегидрогеназа катализирует обратимое превращение пировиноградной кислоты в молочную. Она состоит из 4 субъединиц и содержит два типа полипептидных цепей: Н- сердечный тип (от англ. heart- сердце) и М - мышечный тип (от англ. muscle- мышца). Этот фермент благодаря различным сочетаниям субъединиц может существовать в 5 формах:

Для каждой ткани в норме характерно свое соотношение форм (изоферментный спектр) ЛДГ. Например, в сердечной мышце преобладает Н₄, т.е. ЛДГ₁, а в скелетных мышцах и печени – М₄ (ЛДГ₅). Изучение появления изоферментов ЛДГ в сыворотке крови позволяет судить о месте патологического процесса и о степени поражения органа или ткани.

Особую группу ферментов составляют мультимолекулярные ферментные комплексы. Существование таких комплексов ускоряет химические превращения. Если мультиэнзимный комплекс обслуживает единый, многоступенчатый процесс биохимических превращений, его называют метаболоном. Таковы метаболоны гликолиза, цикла Кребса, дыхательная цепь митохондрий и др.

4. Химическая природа кофакторов, их функции в ферментативных реакциях очень разнообразны. Согласно одной из классификаций все коферменты и простетические группы делят на 2 группы:

1. производные витаминов (табл. 1.4.1);

2. невитаминные кофакторы.

Таблица 1.4.1.

Важнейшие коферменты и простетические группы ферментов

Наименование	Участвующий витамин	Группы, подлежащие переносу
Никатинамидадениндинуклеотид (NAD, NADР)	Никотинамид, витамин РР	Атомы водорода (электроны)
Флавинмононуклеотид, рибофлавинфосфат (FMN, FAD)	Рибофлавин, витамин В2	Атомы водорода (электроны)
Коэнзим А (СоА)	Пантотеновая кислота	Ацильные, ацетильные и др. группы
Тетрагидрофолиевая кислота (ТГФ)	Фолиевая кислота	Метильные, метиленовые, формильные группы или фориминогруппы (одноуглеродные остатки)
Биоцитин	Биотин, витамин Н	Двуокись углерода (активная форма СО2)
Тиаминдифосфат (TDP)	Тиамин, витамин В1	Альдегиды и кетоны
Пиридоксаль-5-фосфат (P5P)	Пиридоксин, витамин В6	Аминогруппы, карбоксильные группы
Дезоксиаденозил- и (метил)-кобаломин (В12 - коферменты)	Цианкоаломин, витамин В12	Атомы водорода, протоны и электроны

К невитаминным кофакторам относят следующие соединения: НS-глутатион, АТР, липоевую кислоту, производные нуклеозидов (уридинфосфат, цитидинфосфат, фосфоаденозинфосфосульфат), порфиринсодержащие вещества и др. К ним же могут быть отнесены тРНК, которые в составе ферментов аминоацил-тРНК-синтетаз принимают активное участие в транспортировке аминокислот в рибосому, где осуществляется синтез белка.

Следует отметить одну отличительную особенность двухкомпонентных) ферментов: ни кофактор отдельно (включая большинство коферментов), ни сам по себе апофермент каталитической активностью не наделены, и только их объединение, протекающее не хаотично, а в соответствии с программой их структурной организации, обеспечивает быстрый ход химической реакции.