4. Механизмы наследования групп крови.

Гены, отвечающие за группу крови человека по системе АВО располагаются на длинном плече хромосомы 9. Выделяют три основных варианта таких генов (аллеля): I^А, I^В и i⁰. Последний не кодирует какого-либо антигена, и является рецессивным по отношению к каждому из аллелей I^А и I^В, являющимся в равной степени доминантными, то есть при наличие в одной из гомологичных хромосом гена I^А, а в другой - I^В, на мембране эритроцитов будут присутствовать и антигена А, и антигены В. Такой тип взаимодействия аллельных генов называется кодоминирование. Все возможные варианты сочетаний описанных аллелей приведены в таблице (прил. 3), из которой видно, что первая группа развивается у людей с генотипом i⁰i⁰, вторая – либо I^АI^А (гомозиготное состояние), либо I^Аi⁰ (гетерозиготное состояние), третья - либо I^ВI^В, либо I^Вi⁰, а четвертая - I^АI^В.

Резус-фактор наследуется по рецессивно-доминантному типу. Резус-фактор определяется двумя аллелями: D - доминантный (Rh+) и d – рецессивный (Rh-). Фенотип Rh+ проявляется как при гомозиготном, так и при гетерозиготном генотипе, а фенотип Rh- проявляется только при гомозиготном генотипе (dd), то есть наблюдается полное доминирование.

5. Цоликлоны.

Цоликлон – это солевой раствор моноклональных антител к антигенам, расположенным на поверхности эритроцитов человека. Моноклональные антитела для цоликлонов получают путем генной инженерии из крови стерильных мышей. В настоящее время существует большое количество цоликлонов к различным антигенам, которые предназначены для определения групп крови по различным системам. Для определения группы крови по системе АВО используются цоликлоны анти-А, анти-В и анти-АВ (представляет собой смесь моноклональных анти-А и анти-В антител). Для определения резус- фактора применяется цоликлон анти-D. Преимущество цоликлонов заключается в том, что они отличаются более высокой активностью и выраженностью реакции склеивания эритроцитов по сравнению со стандартными агглютинирующими сыворотками.

2. Методика выполнения работы

   1. Определение групп крови.

Первым шагом на пути достижения поставленной цели стало освоение метода определения антигенов системы АВО с использованием набора цоликлонов, состоящего из четырех пузырьков с реагентами (моноклональные цоликлоны анти-А, анти-В, анти-АВ и анти-D супер).

Определение антигенов системы АВО производилось в крови, взятой из пальца. Для отбора крови применялись одноразовые ланцеты и ручка для прокалывания из набора глюкометра «Сателлит Экспресс». Использовался метод прямой гемагглютинации на плоскости. Определение группы крови производилось в помещении с хорошим освещением при температуре 15-25°С.

Этапы определения:

• Одноразовый планшет с лунками разместить на листе бумаги, сделав подписи соответствующих цоликлонов рядом с ячейками;

• В лунки одноразового планшета нанести по одной капле исследуемой крови (0,01-0.03 мл);

• Добавить цоликлоны анти-А, анти-В, анти-АВ и анти-D по одной большой капле (0,05 мл) в соответствующие ячейки;

• Разными зубочистками или одноразовыми носиками от микропипетки смешать кровь с реагентом;

• Наблюдать за ходом реакции с цоликлонами визуально при легком покачивании планшета. Агглютинация эритроцитов с цоликлонами обычно наступает в первые 3-5 сек, но наблюдение стоит вести 3 мин ввиду более позднего появления агглютинации с эритроцитами, содержащими слабые разновидности антигенов А или В;

• Результат реакции в каждой лунке может быть положительным или отрицательным. Положительный результат выражается в агглютинации (склеивании) эритроцитов. Агглютинаты видны невооруженным глазом в виде мелких красных агрегатов, быстро склеивающихся в крупные хлопья. При отрицательной реакции капля остается равномерно окрашенной в красный цвет, агглютинаты в ней не обнаруживаются. Положительный результат означает, что исследуемые эритроциты содержат антиген, соответствующий специфичности сыворотки, отрицательный - отсутствие в исследуемых эритроцитах соответствующего антигена.

Интерпретация результатов реакции агглютинации исследуемой крови с цоликлонами представлены в приложении 4 и 5.

Первоначально, для верной трактовки результатов агглютинации и подтверждения ее протекания или не протекания, проводилось микроскопирование образцов смеси крови и цоликлонов методом раздавленной капли. Отбор капли в объеме 0,1 мл из смеси проводился с помощью одноканального механического дозатора. Для микроскопирования использовался световой микроскоп от фирмы «Микромед» с максимальным увеличением в 1000 раз. Перенос изображения на цифровой носитель осуществлялся с помощью цифровой видеокамеры ToupCam.