Химический мутагенез

Химический мутагенез - получение мутаций под воздействием каких-либо биологических активных соединений - химических мутагенов. Выделяют следующие группы химических мутагенов: алкилирующие соединения; окислители, восстановители и свободные радикалы; аналоги азотистых оснований; ингибиторы предшественников нуклеиновых кислот; акридиновые красители.

Генетический эффект химических мутагенов во многом отличен от действия радиации. Так, если под воздействием радиации чаще возникают хромосомные аберрации, то под действием химических мутагенов чаще возникают генные мутации.

Химические мутагены более специфичны в отношении объектов воздействия и индуцируемых ими изменений. Наиболее сильные химические мутагены (получившие название «супер-мутагенов») вызывают повторно одни и те же типы мутаций, а также затрагивают признаки, играющие существенную роль в видовой и даже родовой систематике.

Кроме того, химические мутагены способны индуцировать мутации, которые не возникают спонтанно и под действием радиации. Ряд мутагенов действует подобно радиации, вызывая хромосомные аберрации. Такие вещества называют радиомиметическими (например, иприт).

Для сравнения влияния разных мутагенов на биологические показатели, наследственный аппарат которых подвергался мутагенному воздействию, разработана комплексная система оценки мутагенов. Эта система представляет собой группу следующих тестов, оценивающих действие мутагенов на разных уровнях (хромосомном, клеточном, организменном): общий и генетический летальный эффект; цитогенетический эффект; частота генных мутаций в отдельных локусах; частота и спектр видимых морфологических аномалий; фенотипическая изменчивость количественных (селекционных) признаков.

Каждый взятый в отдельности тест не содержит в себе достаточной информации, но совокупность их позволяет получить сведения, достаточные для объективной оценки эффективности мутагенов в селекционно-генетических работах с рыбами.

Общий и генетический летальный эффект мутагенов

Под общим летальным эффектом различных мутагенов понимают снижение жизнеспособности особей в ближайший (после воздействия мутагеном) период.

При установлении общего летального эффекта мутагенов жизнеспособность зародышевых клеток и самих зародышей является важнейшим, наиболее выраженным показателем, дающим первую (часто решающую) информацию о целесообразности дальнейшего применения того или иного вещества.

Общий летальный эффект химических соединений может быть следствием как необратимых изменений в генном материале, так и инактивации жизненно важных ферментов и других внутриклеточных структур, т.е. может иметь генетическую и физиологическую природу.

Проявлением общего летального эффекта является потеря оплодотворяющей способности у спермиев, что связано с повреждением цитоплазматических структур половой клетки. Установлено, что цитоплазматическая (физиологическая) устойчивость у спермиев прудовых рыб к токсическому действию алкилирующих соединений, как и к радиации, более чем в 3 раза выше устойчивости хромосом.

Оплодотворяющая способность спермиев, обработанных сильными химическими мутагенами, остаётся на высоком уровне при использовании широкого диапазона доз, а число развивающихся зародышей заметно снижается по отношению к контролю только при самых высоких концентрациях мутагенов (табл. 1). Различия между самими мутагенами по способности угнетать оплодотворяющую способность спермиев также проявляются только при высоких концентрациях. Наиболее токсичными являются НМБ, НММ и ДМС.

Мутагенная обработка может приводить к повышению оплодотворяющей способности спермиев. Особенно отчетливо это проявляется, когда воздействию мутагенов подвергается сперма невысокого качества (табл. 1, данные по белому толстолобику). Стимулирующее действие алкилирующих соединений на зрелые спермии рыб может быть связано с активизирующим влиянием комплексов между мутагенами и ферментами.

Генетический летальный эффект мутагенов, проявляющийся у рыб (полученных с использованием обработанной мутагенами спермы), является результатом возникновения доминантных летальных мутации.

Таблица 1. Выживаемость эмбрионов при воздействии на спермии разных видов рыб химическими мутагенами

Мутаген	Концентрация мутагенов, %				Контроль
	0,02	0,01	0,005	0,0025
Карп*
ДМС	7,0	10,2	58,6	70,5	74,0
ДЭС	41,8	42,2	53,9	74,0	58,2
НЭМ	22,1	61,2	92,0	87,5	78,6
НММ	-	-	0	12,0	57,8
НМБ	-	0	11,2	52,3	68,3
ЭИ	0	17,0	86,0	94,3	82,7
Большеротый буффало*
НЭМ	7,9	19,7	23,9	24,7	41,0
Белый толстолобик*
ДМС	0	8,3	42,0	-	39,0
НЭМ	0	4,7	2,4	19,1	52,3
Белый амур*
НЭМ	0	0,2	0,8	25,7	40,3
Радужная форель*
ДМС	0	26,4	32,9	56,2	78,1
НММ	25,9	21,4	39,3	62,7	85,2
Пелядь*
ДМС	4,7	-	-	-	69,3
*Тетраплоидные виды

В эмбриогенезе из показателя общей индуцированной эмбриональной смертности вычитают показатель индуцированной смертности зародышей на стадии бластулы.

Первый показатель (общая индуцированная эмбриональная смертность) - определяют как разность между выживаемостью в контрольном и мутагенном потомствах за весь период эмбриогенеза;

Второй показатель - также определяют как разность между выживаемостью до стадии бластулы в контрольном и мутагенном потомствах.

Например (табл. 1), после обработки спермы карпа ДМС в концентрации 0,01% индуцированная общая смертность потомков в эмбриональном периоде составляет 74,0 - 10,2 = 63,8%, а индуцированная смертность зародышей за период от оплодотворения до стадии бластулы — 76,1 - 70,5 = 5,6%. Таким образом, эмбриональная смертность, обусловленная летальными генетическими мутациями, составляет в данном случае 63,8 - 5,6 = 58,2%.

Действие химических мутагенов, результатом которого является генетический летальный эффект, у разных видов животных проявляется по-разному. Существенные различия по частоте индуцированных летальных исходов установлены для особей с разной степенью плоидности.

Так, диплоидные формы, к которым относятся белый толстолобик и белый амур, оказались намного чувствительнее к мутагенам, чем карп, буффало, форель и пелядь, имеющие тетраплоидную природу.

Причиной этого является не различная чувствительность к мутагенам генного материала спермиев разных видов, а различные механизмы реализации генетических повреждений у диплоидных и полиплоидных видов рыб.

Различия в чувствительности к действию мутагенов можно наблюдать не только у разных видов рыб, но и среди представителей одного вида. Это создает некоторое расхождение в результатах мутагенных воздействий, выполненных в идентичных условиях. При этом чувствительность к мутагенам не зависит от общей жизнеспособности рыб в норме (Рис2).

Рисунок 2. Чувствительность к разным дозам НММ двух потомств карпа при воздействии мутагеном на зрелые спермии: I и II - номера потомств.

Как указывалось выше, реализация летальных изменений, возникшая в генном материале обработанных спермиев, начинается не сразу, а со стадии поздней бластулы и в дальнейшем в зависимости от характера индуцированных повреждений может проходить на разных стадиях эмбрионального и постэмбрионального развития.

Поэтому сравнение и оценку генетических летальных эффектов разных мутагенов проводят по показателям общей жизнеспособности рыб в течение первого года жизни.

Со стадии поздней бластулы начинают проявляться и особенности повреждающего действия разных химических мутагенов (Рис).

Например, подавляющая часть доминантных летальных мутаций, индуцированных у карпа с помощью ДМС, реализуется в течение эмбрионального развития, в основном на стадии гаструлы, но в дальнейшем смертность рыб незначительна.

Рисунок 3. Выживаемость карпов в течение первого года жизни, после обработки спермы химическими мутагенами: 1 - ДМС (концентрация 0,0012%); 2 - ДАБ (0,005%); 3 - НЭМ (0,0025%); Л - контроль (без мутагена).

Хромосомные мутации могут быть связаны с изменением структуры хромосом и их числа. В основе структурных изменений хромосом (так называемых хромосомных перестроек) лежит разрыв хромосомы, что ведет либо к потерям (нехваткам), либо, наоборот, к увеличению (дупликациям) отдельных участков хромосом и расположенных в них генов.

Результатом хромосомного разрыва и последующего неправильного воссоединения образовавшихся фрагментов может быть также изменение последовательности генов на хромосоме (инверсия), обмен участками между негомологичными хромосомами (транслокация) и другие серьезные нарушения. Однако их никогда не нужно смешивать с генными мутациями, при которых перестройка происходит на молекулярном уровне.

Изменения числа хромосом могут происходить в результате либо случайного увеличения, либо потери одной или нескольких хромосом. Особи — носители таких изменений хромосомного набора называются анеуплоидами. В случае увеличения числа хромосом, кратного гаплоидному, возникают полиплоиды, которые в зависимости от числа гаплоидных наборов в ядре могут быть триплоидами (3n), тетраплоидами (4n) и т.д.

Последствия мутаций чрезвычайно разнообразны, непредсказуемы и зависят от большого числа факторов. Например, мутации, появившиеся в соматических клетках, не передаются потомству, но могут вызывать различные изменения у пораженной особи. При этом мутация, возникшая на ранней стадии эмбрионального развития, дает большее число клеток с измененным «мутантным» генотипом. Мутации в половых клетках не затрагивают родительский организм, но передаются потомству.

Подавляющее большинство новых мутаций приводит к более или менее выраженным изменениям в физиологии и строении организма, снижает его жизнеспособность. Результатом многих макромутаций являются тяжелые уродства, частичная (или полная) стерильность, резкое снижение жизнеспособности, вплоть до летального исхода.