ЗАНЯТИЕ 7

Тема: ФИЗИОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ.

МЕТАБОЛИЗМ И ПИТАНИЕ МИКРОБОВ. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ.

ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ (I и II этапы)

Цель занятия: изучить химический состав, процессы метаболизма и типы питания бактериальной клетки; познакомиться с питательными средами, освоить технику приготовления питательных сред; методы посева микробов на жидкие и твердые питательные среды; освоить технику забора исследуемого материала для микробиологического исследования; изучить этапы выделения чистой культуры аэробов и выделить чистую культуру.

Вопросы для обсуждения

1. Химический состав бактериальной клетки.

2. Роль бактерий в круговороте веществ в природе.

3. Катаболизм и анаболизм как составные части процесса метаболизма.

4. Питание бактерий. Источники питания микроорганизмов.

5. Классификация бактерий по типам питания. Понятие об аутотрофах, гетеротрофах, сапрофитах, абсолютных и факультативных паразитах, прототрофах, ауксотрофах.

6. Транспорт веществ в бактериальную клетку: энергонезависимый (простая и облегченная диффузия), энергозависимый (активный, транслокация радикалов).

7. Питательные среды, их классификация, характеристика

8. Требования, предъявляемые к питательным средам, этапы приготовления, контроль готовых сред.

9. Материал для бактериологического исследования.

10. Методы, правила забора, хранения и транспортировки исследуемого материала.

11. Выделение чистой культуры (1 день микробиологического анализа).

12. Методы (условия) культивирования микроорганизмов. Понятие об аэробах и анаэробах.

13. Методы и техника посевов для выделения чистой культуры.

Оформление протокола для лабораторного занятия

1. Записать в протокол номер, тему и цель занятия

2. Записать правила забора, хранения и транспортировки материала для микробиологического исследования

3. Нарисовать схему рис 7.3 «Механизмы транспорта через ЦПМ».

4. Составит и записать классификацию питательных сред.

5. Зарисовать или вклеить (на разворот в тетради) цветное фото схемы «Этапы выделения чистой культуры аэробов и анаэробов» (стенд из кабинета 207).

6. Зарисовать методы механического разобщения бактерий при посеве.

Задания для выполнения лабораторной работы

1. Познакомиться с питательными средами. Записать схему их классификации по происхождению, консистенции, назначению.

2. Ознакомиться с методами и техникой посева на жидкие и плотные питательные среды.

3. Изучить этапы выделения чистой культуры микробов.

4. Приступить к выделению чистой культуры (1 день):

- Произвести забор материала из зева и носа и произвести посев отобранного материала на твердую дифференциально-диагностическую среду ЖСА для выделения культуры стафилококка.

- Приготовить мазок из нативного материала, окрасить синькой Лёффлера или по Граму, дать оценку микробного фона нативного материала, зарисовать.

- Записать ход исследования по выделению чистой культуры стафилококка (1-й день).

МАТЕРИАЛ К ИЗУЧЕНИЮ.

Правила забора, хранения и транспортировки материала для микробиологического исследования.

Материалом для исследования служат кровь, гной, моча, мокро­та, ликвор, кал, рвотные массы, отделяемое половых органов, промывные воды, и ткань (биопсия от живого организма или аутопсия от трупа). А также на исследование берут объекты окружающей среды: воздух, воду, пищевые продукты, смывы, лекарственные средства.

При взятии материала для микробиологического исследования необходимо соблюдать следующие правила. Количество материала должно быть достаточным для проведения исследования и при необходимости его повторения. Материал берут по возможности в начальном периоде болезни, так как именно в этот период воз­будители выделяются чаще, их больше, они имеют более типич­ную локализацию. Материал должен быть взят до начала анти­микробной химиотерапии или через определенный промежуток времени после введения антибактериального препарата, необхо­димый для его выведения из организма. Материал берут непо­средственно из очага инфекции или исследуют соответствующее отделяемое (гной, мочу, желчь и др.) в момент наибольшего со­держания в нем возбудителя.

Необходимо исключить возможность контаминации материа­ла нормальной флорой больного и микробами окружающей сре­ды, для чего создают асептические условия при адекватном дос­тупе к источнику инфекции. Следует предупредить попадание в материал антимикробных препаратов (дезинфектантов, антисеп­тиков, антибиотиков). Любой клинический материал должен рас­сматриваться как потенциально опасный для человека, поэтому при его заборе, хранении, транспортировке и обработке необхо­димо соблюдать все правила биологической безопасности.

Транспортировку материала в лабораторию следует проводить в максимально короткие сроки, соблюдая температурный режим, чтобы исключить гибель неустойчивых видов микроорганизмов, или помещать его в специальные транспортные среды. К материалу прилагают сопроводительный документ, содержащий основные сведения, необходимые для проведения микробиологического исследования (фамилия, имя и отчество больного, номер истории болезни, клинический диагноз и т. д.).

В процессе транспортировки материал следует оберегать от действия света, тепла, холода, от механических повреждений, что­бы исключить гибель микробов и контаминацию материала посто­ронней микрофлорой. Лучше всего доставлять материал в специальных металлических изотермических контейнерах, которые лег­ко очищать и обеззараживать.

Этапы приготовления питательных сред

а) варка (согласно прописи питательной среды в дистиллированную воду вносят необходимые компоненты и растворяют при нагревании);

б) установление рН с помощью потенциометра с учетом того, что после стерилизации рН среды снизится на 0,2 (для подщелачивания используют 0,1 н раствор NaOH, для подкисления - 0,1 н раствор HCI);

в) осветление среды с помощью яичного белка, лошадиной сыворотки или путем отстаивания (осаждения);

г) фильтрация через фильтровальную бумагу (жидкие среды) или ватно-марлевые фильтры (агаровые среды);

д) разливка питательных сред;

е) стерилизация;

ж) контроль готовых сред (стерильности, химический, биологический).

Контроль режима стерилизации осуществляется с помощью химических термотестов и искусственных биотестов.

Требования, предъявляемые к питательным средам.

Для обеспечения разнообразных типов метаболизма микроорганизмов питательные среды должны соответствовать следующим требованиям:

1. Содержать воду, так как все процессы жизнедеятельности бактерий протекают в воде.

2. Для культивирования гетероорганотрофных бактерий в среде должен содержаться органический источник углерода и энергии. Эту функцию выполняют различные органические соединения: углеводы, аминокислоты, органические кислоты, липиды. Наибольшим энергетическим потенциалом обладает глюкоза, так как она непосредственно подвергается расщеплению с образованием АТФ и ингредиентов для биосинтетических путей. Часто используется в этих целях пептон – продукт неполного гидролиза белков, состоящий из поли-, олиго- и дипептидов. Пептон также поставляет аминокислоты для построения бактериальных белков.

3. Для синтеза белков, нуклеотидов, АТФ, коферментов бактериям требуются источники азота, серы, фосфаты и другие минеральные вещества, в том числе микроэлементы. Источником азота может служить пептон. Большинство бактерий способны использовать соли аммония в качестве источника азота. Серу и фосфор бактерии способны утилизировать в виде неорганических солей: сульфатов и фосфатов. Для нормального функционирования ферментов бактериям требуются ионы Са²⁺, Mg²⁺, Mn²⁺, Fe²⁺, которые добавляют в питательную среду в виде солей, чаще всего фосфатов.

4. Решающее значение для роста многих микроорганизмов имеет рН среды. Поддерживание определенного рН имеет значение для предотвращения гибели микроорганизмов от ими же образованных про­дуктов обмена. С этой целью питательную среду забуферивают, чаще всего используя фосфатный буфер. При сильном выделении бактериями кислот, как продуктов обмена, добавляют к питательной среде карбонат кальция – СаO₂.

5. Среда должна обладать определенным осмотическим давлением. Большинство бактерий способны расти на изотоничных средах, изотоничность которых достигается добавлением NaCl в концентрации 0,87%. Некоторые бактерии не способны расти на средах при концентрации соли в них ниже 1%. Такие бактерии называются галофильными.

Так как устойчивость к осмотическому давлению определяется наличием у бактерий клеточной стенки, то бактерии, лишенные клеточной стенки, микоплазмы и L-формы могут расти на питательных средах, содержащих гипертонический раствор, обычно раствор сахарозы.

При необходимости к питательной среде добавляют факторы роста, ингибиторы роста определенных бактерий, субстраты для действия ферментов, индикаторы.

6. Питательные среды должны быть стерильными во избежание искажения результатов исследования.

Факторы роста микробов. У ряда микробов под воздействием ничтожно малых количеств ростовых веществ увеличивается накопление микробной массы и изменяется обмен веществ. По химической структуре и физиологическому действию стимуляторы являются подлинными витаминами или витаминоподобными веществами. Витамины или ростовые вещества играют главным образом роль катализаторов (ускорителей) биохимических процессов в бактериальной клетке. Они же являются структурными единицами при образовании некоторых ферментов.

Кроме витаминов, к факторам роста бактерий относятся пуриновые и пиримидиновыс основания и их производные (аденин, гуанин, цитозин, тимин, урацил, ксантин и гипоксантин). Например, для гемолитического стрептококка фактором роста является аденин, для золотистого стафилококка — урацил, возбудителя столбняка — аденин или гипоксантин.