Е. Пептидні гормони, міметики та їхні аналоги

; Р. Препарати з антиестрогенною активністю |О. Маскуючі пропарити

2. Заборонені методи впливу

Д. Стимуляція транспорту кисню

2. Фармакологічні, хімічні та фізичні маніпуляції

3. Генний допінг

2. Класи субстанцій, заборонених в окремих видах спорту ' А. Алкоголь

2. Каннабіноїди

3. Місцеві анестетики

О. Глюкокортикоїди

Е. Бета-блокаторн

Для деяких лікарських препаратів і речовин, таких, як бета-блокатори, кортикостероїди, місцеві анестетики, марихуана й алкоголь, заборона на використання обмежується окремими видами спорту з урахуванням ме­дичних показань.

Стимулятори. Стимулятори, очевидно, найбільш давній вид субстан­цій, які використовувалися людиною як допінг. До них відносять: амфета- мін, ефедрин, кофеїн, кокаїн. Перша допінгова речовина, яка виявлена у зразках сечі спортсменів XX ст., належала до амфетамінів. Оскільки ефе­дрин входить до складу ряду протизастудних препаратів, а кофеїн містить­ся у багатьох холодних і гарячих напоях, було встановлено межу гранич­ного вмісту цих речовин у сечі, що вимагає проведення кількісної оцінки в ній їхнього вмісту. Нові правила, які набули чинності з січня 2004 р., повністю зняли заборону на використання кофеїну.

Наркотичні речовини. Клас наркотичних речовин включає такі суб­станції, як опіоїдні аналгетики морфінового типу і близькі за структурою речовини, за винятком, зокрема, етил морфіну і кодеїну, зробленим через їхній незначний аналгетичний вплив. Використання інших лікарських препаратів неопіоїдного типу, наприклад, ацетилсаліцилової кислоти або диклофенаку, дозволяється.

Анаболічні препарати. Якщо використання стимуляторів і наркотиків становить інтерес під час змагань, то анаболічні препарати є ефективним засобом впливу в період проведення тренувальних занять. Речовини, які стимулюють ріст м’язової тканини і збільшення силових показників, було внесено до списку заборонених субстанцій МОК у 1976 р., а після 1993 р. в клас анаболічних препаратів було включено не тільки стероїди — похідні тестостерону, а й інші, такі, як кленбутерол, оскільки бета-2-агоністи та­кож викликають анаболічний ефект за умови їх використання в дозах, які суттєво перевищують терапевтичні.

Діуретики розглядаються як допінгові препарати на основі таких фактів: спортсмени, які змагаються у видах спорту, де відбувається по­діл на вагові категорії, можуть знижувати масу тіла штучно стимульо­ваним діурезом, тобто збільшенням відділення сечі; збільшення водних витрат призводить до розбавлення сечі і зниження концентрації виділь­них речовин. Таким чином, діуретини можуть маскувати використання заборонених субстанцій, для яких встановлено кількісний поріг вмісту в сечі. Клас діуретинів, зокрема, може слугувати демонстрацією фізико- хімічної гетерогенності однієї групи препаратів. На основі хімічної структури, місця і механізму впливу діуретичні препарати можуть бути розподілені приблизно на шість груп. Це так звані тіазиди (наприклад, гідрохлортіазид), похідні сульфамоїлбензойної кислоти (наприклад, фу- росемід), осмотичні діуретини (наприклад, манітол), інгібітори карбоан- гідрази (наприклад, ацетазоламід), похідні феноксіоцтової кислоти (на­приклад, етакринова кислота) і калійзберігаючі діуретини (наприклад, спіронолактон).

Бета-блокатори. Препарати, які блокують бета-адренорецептори, забо­ронені для використання в таких видах спорту, як стрільба і стрибки на ли­жах з трампліна через їхній седативний ефект. До сучасних бета-блокаторів відносять такі препарати: атенолол, бетаксолол, бісопролол, метопролол, надолол, піндолол, пропранолол, тімолол, карведілол, небіволол. Почина­ючи з 1988 р., цей клас препаратів було включено Міжнародним олімпій­ським комітетом у список заборонених для використання субстанцій.

Сучасні методи аналізу

Перші методики скринінгу і доказів для допінг-контролю полягали у виготовленні зразків препаратів із використанням рідинної екстракції сечі, концентрації отриманих екстрактів і розділенні речовин, що аналізу­ються, за допомогою газорідинної хроматографії (ГРХ) і тонкошарової хро­матографії (ТШХ). Для аналізу продуктів, розділених за допомогою ГРХ, використовували плазмо-іонізуючий детектор (ПІД), який дозволяв ви­явити наявність стимуляторів із групи амфетаміну за сигналом часу утри­мання, що зіставляють зі стандартними зразками аналогічних препаратів. ТШХ використовували для ідентифікації стрихніну і таких стимуляторів з гідроксильованим кінцем, як р-гідроксиаміфетин і фенілефрин. У випад­ках із позитивними результатами тесту додаткову інформацію отримували за допомогою дериватизації, мікроінфрачервоної спектроскопії, а також мас-спектроскопії (МС).

Удосконалення аналітичних методів і поява різних технічних новинок привели до розробки складних процедур приготування зразків і появи різ­номанітних видів аналізу і, як наслідок, до створення і випуску в продаж спеціального обладнання, що дозволяє проводити великий аналіз зразків, зокрема сечі, елітних спортсменів з метою допінг-контролю. Залежно від властивостей речовин, що аналізуються, використовують різні аналітичні інструменти. Сучасні хроматографічні системи базуються на використанні капілярної газової хроматографії або високоефективної рідинної хромато­графії.

Га.юва хроматографія. Сьогодні капілярні колонки є найпоширені­шим засобом для проведення газової хроматографії (ГХ) з метою допінг- контролю. Висока ефективність методу забезпечує широкий вибір для ство­рення різних методик і можливостей із метою вирішення таких завдань, як проведення повного аналізу або скринінгу специфічних речовин.

Рідинна хроматографія. Порівняно з газовою рідинна хроматографія (РХ) виокремлюється значним різномаїттям наповнювачів і, оскільки роз­ділення відбувається за умови перенесення в рідкому носії, великим набо­ром розчинників і буферів. На відміну від ГХ, РХ має декілька механізмів розділення (нормально-фазовий, зворотно-фазовий, іонообмінний і сито­вим), чим забезпечується її висока ефективність під час проведення аналізу з метою допінг-контролю.

Імуноафінна хроматографія (ІАХ). Для виділення аналізованих речо­вин із біологічних проб 1АХ стали використовувати відносно недавно. Суть методу полягає у тому, що моно- або поліклональні антитіла здатні утво­рювати нековалентний зв’язок із різними частинами молекул, що аналізу­ються, “пришивають” до носія, наприклад, до сферичних часточок агаро- зи. Гелем із таких часточок заповнюють колонку з пористим фільтром на одному кінці та пропускають через неї проби сечі або плазми. Під час про­пускання через колонку аналізованих речовин антитіла, пов’язані з носі­єм, розпізнають їх і зв’язують, формуючи нековалентні комплекси. Решта молекул, не здатних взаємодіяти з антитілами, витягуються розчинником. Зміна умов елюювання дозволяє зруйнувати комплекс речовина—антиті­ло, не руйнуючи при цьому самих молекул, і отримати аналізовану речови­ну в очищеному вигляді, практично без сторонніх домішок, для проведен­ня подальшого аналізу за допомогою ГХ-МС.

Детектори. Детекція та ідентифікація розділених хроматографією речовин у допінг-контролі мають надзвичайно велике значення. Сьогодні розроблено багато різних систем детекції, зокрема плазмо-іонізуючий де­тектор, азотно-фосфорний детектор, УФ фотометричний детектор, а також мас-спектрометричні детектори. На прикладі плазмо-іонізуючого детекто­ра, який дуже давно широко використовується з ГХ, пояснено принцип ро­боти детектора. Газ, що виходить з хроматографічної колонки, змішується з повітрям, насиченим воднем, і спалахує за допомогою електропідпалу. Під час згоряння водню в повітрі утворюється невелика кількість іонів, однак за умови піролізу в полум’ї водню більшість органічних сполук дає значну кількість іонів і електронів і це призводить до збільшення провід­ності. На так званий колектор або збірний електрод подається напруга, під впливом якої виникає електричний струм, величина якого пропорцій­на кількості зразка, що згорів після виходу із хроматографічної колонки. Струм реєструється за допомогою амперметра, перетворюється в електрич­ний сигнал і відображається у вигляді піка на хроматограмі.

Якісний аналіз під час проведення допінг-контролю. Для більшості суб­станцій, заборонених у професійному спорті, для позитивного результату тесту достатньо отримати підтверджейня їх наявності у зразку сечі. Оскільки багато методів скринінгу й отримання доказів ґрунтуються на використанні хроматографії в поєднанні з мас-спектроскопією, було розроблено рекомен­дації для ідентифікації сполук за допомогою систем ГХ-МС і РХ-МС/МС.

Присутність речовини вважається підтвердженою, якщо за наявності відповідної кількості характерних іонів (залежно від використаної мас- спектрометрії) зразок, зіставлений з урахуванням допустимих відхилень, відповідає аналогічному зразку стандарту.

Крім того, час зберігання речовин зразка сечі спортсмена не повинен від­різнятися (у межах допустимого інтервалу відхилення) від часу зберігання контрольного зразка. Через це для характеристики та ідентифікації речо­вин у таких складних для аналізу зразках, як проба сечі, суттєве значення має інформація про хроматографічні і, особливо, мас-спектрометричні па­раметри досліджуваних хімічних сполук. На сьогодні проведено численні дослідження мас-спектрометричних характеристик стимулюючих і маску­ючих препаратів, а також розроблено методи їх детекції з метою проведен­ня допінг-контролю. Розглянемо загальні принципи проведення аналізу деяких із цих речовин.

Анаболічні стероїди. Розглядаючи статистичні дані про результати про­ведених тестів на допінг і класи виявлених заборонених речовин, можна помітити, що найчастіше як допінг у спорті використовують анаболічні стероїди. Одним із представників цієї групи є метилтестостерон — похідне тестостерону, отримане шляхом заміни метальною групою залишку водню.

Анаболічні стероїди переважно активно залучаються в метаболічні про­цеси, утворюючи серію метаболітів, наприклад, відповідних кетогруп, здійснюють окиснення гідроксильних груп, гідроксилювання, а також окиснення/відновлення зв'язків вуглець—вуглець у ядрі молекули стеро­їду. За фазою І метаболізму відбувається фаза II, а саме — кон’югація про­дуктів фази І з глюкуронідами або сульфатами.

Загальноприйняті стратегії ідентифікації метаболітів анаболічних сте­роїдів ґрунтуються на ферментативному гідролізі метаболітів фази II, у про­цесі якого утворюються метаболіти фази І, потім здійснюється їх очищен­ня, концентрація, дериватизація й аналіз ГХ-МС. Більшість метаболітів анаболічних стероїдів, за винятком нандролону, про який мова піде далі, не здатні утворюватися в організмі людини природним шляхом, через це у разі виявлення цих сполук у сечі спортсмена, підданого допінг-контролю, буде зроблено повідомлення про позитивні результати тесту.

Синтезовані стероїди. Проблема використання так званих сконстру­йованих стероїдів набуває все більшого значення після того, як у 2003 р. лабораторія допінг-контролю виявила речовину, похідну гестринону — лі­карського препарату, який використовувався для лікування ендометріозу. Гідрогенування його залишку призводить до утворення гормону тетрагід- ротестринону, який може розглядатися як аналог високоефективного ана- болічного стероїду тренболону. Однак клінічні дослідження фізіологічно­го впливу й побічних ефектів ніколи не проводились. Загальноприйнятих стратегій допінг-контролю, які були спрямовані на виявлення фармацев­тичних препаратів, що пройшли випробування, виявилось недостатньо для подолання бажання деяких спортсменів отримати перемогу над супер­никами обманним шляхом, піддаючи ризику власне здоров'я. Врахову­ючи той факт, що багато процедур скринінгу ґрунтуються на порівнянні зразків із пробами сечі з використанням таких методик мас-спектрометрії, як моніторинг заданих іонів (selected ion monitoring, SIM) або моніторинг множинних реакцій (multiple reaction monitoring, MRM), невідомі похід­ні або лікарські препарати, такі, як тетрагідротестринон, є “невидимими” для стандартних процедур контролю. Це обумовлює необхідність розробки гнучкіших методик контролю, які б дозволили детектувати як відомі, так і невідомі речовини, котрі мають схожу структуру, що в принципі можливо, зокрема, з використанням сучасних систем ГХ-МС/МС.

Ендогенні стероїди. Виявити анаболічні стероїди, які не зустрічаються в нормі, не становить великих труднощів, але якщо як допінг застосовуєть­ся тестостерон, це значно ускладнює його тестування, оскільки він вироб­ляється в організмі людини. З метою виявлення тестостерону розроблено різні підходи, найбільш поширеними з яких є визначення співвідношення тестостерон/епітестостерон і так зване мас-спектрометричне вимірювання співвідношення стабільних ізотопів вуглецю. Збільшення доступності ізо­топного аналізу методом МС дозволило проведення низки досліджень, які показали можливість виявлення різниці між ендогенним і синтетичним тестостероном за допомогою даного підходу.

Діуретини і бета-2 агоністи. До речовин, аналіз яких здійснюється за допомогою ГХ-МС/МС, відносять також діуретики і бета-2-агоністи. Зокрема, група діуретиків характеризується хімічним розмаїттям препа­ратів, що призначаються у схожих або ідентичних випадках. Для пред­ставників цієї групи речовин використовується переважно негативна іоні­зація, що зумовлено їхніми кислотними властивостями, однак для деяких діуретиків, зокрема тріамтерену, вимагається позитивна іонізація. Для бета-2-агоністів основним підходом є протонування аналізованої речовини з наступною детекцією позитивно зарядженої молекули. Для діуретиків, а також для переважної більшості бета-2-агоністів, за винятком салбутамо- лу, достатньо проведення кількісного аналізу.

Кількісний аналіз заборонених субстанцій. Для деяких субстанцій, включно зі стимуляторами на зразок ефедрину, метаболітів анаболічних стероїдів (наприклад, нандролону), і бета-2-агоністів, таких, як салбута- мол, встановлено пороговий рівень, на основі порівняння з якими робить­ся висновок про позитивні або негативні результати тесту. Підґрунтям для такого рішення стали різні причини. Ефедрини входять до складу багатьох лікарських препаратів, які використовують від застуди, через це за анти- допінговими правилами їх використання є законним, якщо вміст похід­них норефедрину, ефедрину і псевдоефедрину в сечі не перевищує 5,10 або 25 мг-мл~* відповідно. Салбутамол належить до групи симпатоміметиків, е одним із чотирьох бета-2-агоністів (поряд з салметеролом, тербуталіном

і формотеролом), що використовуються у вигляді інгаляції з лікувальною метою. Але визначити, як використовувався препарат (орально у вигляді таблеток або у вигляді аерозолю) і в якій дозі, досить складно. Про при­сутність салбутамолу в пробах під час змагань повідомляють у відповід­ну федерацію, якщо вміст речовини перевищує 100 нг-мл'¹. У період між змаганнями встановлено пороговий рівень — 1 мг-мл"¹, оскільки у випадку використання деяких симпатоміметиків у дозах, що суттєво перевищують терапевтичні, спостерігаються анаболічні ефекти. Присутність метаболіту нандролону (норандростерону) у сечі професійних спортсменів може бути певною мірою обумовлена ендогенною продукцією, через це для речовини встановлено пороговий вміст 2 нг-мл"¹ для чоловіків і 5 мг-мл'¹ для жінок. Для обґрунтування отриманих значень проводили відповідні дослідження, а також було враховано різні чинники, які можуть впливати на рівень ен­догенного утворення цього метаболіту, наприклад, значний фізіологічний стрес або вагітність, що призводять до суттєвого підвищення вмісту цієї речовини в сечі. Кількісне визначення цих сполук здійснюється з викорис­танням калібрувальних кривих, які будують на основі результатів визна­чення стандартними методами відповідних внутрішніх параметрів, що ма­ють схожі або ідентичні фізико-хімічні властивості.

Таким чином, допінг-контроль низькомолекулярних сполук у спорт­сменів здійснюється на основі використання хроматографічних і мас- спектрометричних методів, які дають можливість виявити й ідентифіку­вати заборонені препарати та їхні метаболіти в пробах біологічних рідин, таких, як кров і сеча. Останнім часом використовується переважно рідин­на хроматографія, продукти розділення якої після іонізації при атмосфер­ному тиску піддаються мас-спектрометричному аналізу, оскільки даний підхід дозволяє суттєво скоротити час підготовки зразків.